是敵是友？內(nèi)源性外泌體竟轉(zhuǎn)運有功能的gRNA和Cas9蛋白

2019年7月4日，來自北京大學醫(yī)學部天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室的研究團隊在雜志small（IF=10.856）上報道了內(nèi)源性外泌體能轉(zhuǎn)運有功能的gRNA和Cas9蛋白（doi: 10.1002/smll.201902686）(Chen, Huang et al. 2019)。讓我們一起來了解一下。

外泌體是廣泛存在于各種體液中的由細胞分泌的納米級囊泡，并攜帶有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和各類型核酸。它在許多生物過程中都發(fā)揮著重要作用。一些外泌體中的miRNA、lncRNA等已被鑒定為腫瘤的診斷、預后標志物或治療靶標。在另一方面，它也被作為一種藥物轉(zhuǎn)運載體被廣泛研究。除了對傳統(tǒng)藥物的包裝之外，對核酸以及CRISPR-Cas9相關的基因編輯治療藥物的包裝也是研究熱點。例如在Gulei D的報道中，通過在外泌體供體細胞中表達TNF-α獲得表面有TNF-α蛋白的外泌體，然后在將CRISPR-Cas9系統(tǒng)轉(zhuǎn)入外泌體中特異性的識別腫瘤細胞（圖1）(Gulei and Berindan-Neagoe 2019)。

                                         圖1 制備含TNF-α的外泌體轉(zhuǎn)運CRISPR系統(tǒng)

而本文中，作者首先提出問題：外泌體是否能直接轉(zhuǎn)運細胞內(nèi)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)至其他細胞。作者以HBV穩(wěn)定復制的細胞HepAD38為模型，共轉(zhuǎn)染針對HBV的Cas9蛋白和一對sgRNA后，HBV的復制受到30%的抑制。而使用特異性抑制外泌體釋放的抑制劑GW4869處理后，CRISPR系統(tǒng)對HBV的抑制效果顯著降低。這預示著外泌體在這個過程中發(fā)揮著作用。作者便開始驗證外泌體中是否含有Cas9蛋白和gRNA。通過離心和CD63 pull-down的方法提取外泌體后，通過western blot和PCR分別檢測到了外泌體中Cas9蛋白和gRNA的存在。這表明內(nèi)源性外泌體能轉(zhuǎn)運CRISPR-Cas9系統(tǒng)（圖2）。此外，作者也通過tCLN和TRIF的方法驗證了外泌體中gRNA的存在。此外通過對載體片段和未逆轉(zhuǎn)錄樣品的PCR檢測，也證明了外泌體中轉(zhuǎn)運的是gRNA而不是過表達載體。

                                          圖2 CRISPR過表達細胞外泌體中含有Cas9蛋白和gRNA

接下來，作者探究了外泌體轉(zhuǎn)運CRISPR-Cas9系統(tǒng)的機制。Cas9蛋白結(jié)合gRNA后發(fā)揮作用。那外泌體轉(zhuǎn)運Cas9蛋白和gRNA是否需要兩者結(jié)合呢？作者首先通過免疫熒光檢測到了CD63和Cas9蛋白的共定位。通過共轉(zhuǎn)和單轉(zhuǎn)Cas9和gRNA，作者發(fā)現(xiàn)單轉(zhuǎn)Cas9或gRNA后，兩者都能被外泌體轉(zhuǎn)運。這表明兩者被外泌體的轉(zhuǎn)運并無相互依賴的關系（圖3）。

                                          圖3 Cas9蛋白和gRNA的轉(zhuǎn)運無依賴關系

那么，外泌體轉(zhuǎn)運的CRISPR系統(tǒng)是否具有生物活性呢？作者將只表達針對HBV gRNA和Cas9的供體HuH 7細胞和只表達HBV的受體HuH 7細胞共培養(yǎng)；并以只表達Cas9的供體細胞為對照。PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受體細胞中含有被編輯的HBV DNA片段。如圖4所示。此外，為了進一步驗證轉(zhuǎn)運CRISPR系統(tǒng)外泌體的生物學功能，作者從常見得生物工程細胞株Vero和CHO細胞中提取了含Cas9和gRNA的外泌體。該外泌體能作用于HuH 7細胞。共培養(yǎng)后也與上述結(jié)果一致，可以編輯受體細胞。

                                       圖4 外泌體中轉(zhuǎn)運的CRISPR系統(tǒng)具有生物學活性

這一發(fā)現(xiàn)即對外泌體藥物轉(zhuǎn)運研究提供助力，也對那些未發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)脫靶效應和安全性做出警示。最后給出文章的模式圖（圖5）。

                                     圖5 外泌體轉(zhuǎn)運CRISPR系統(tǒng)并作用于受體細胞模式圖
Chen, R., H. Huang, et al. (2019). "Friend or Foe? Evidence Indicates Endogenous Exosomes Can Deliver Functional gRNA and Cas9 Protein." Small: e1902686.
Gulei, D. and I. Berindan-Neagoe (2019). "Activation of Necroptosis by Engineered Self Tumor-Derived Exosomes Loaded with CRISPR/Cas9." Mol Ther Nucleic Acids 17: 448-451.