促癌小分子的新成員——LncRNA ITGB8-AS1

LncRNA在結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，但大多數(shù)lncRNA在CRC中的功能及其分子機(jī)制尚不清楚。本文發(fā)現(xiàn)lncRNA ITGB8-AS1在CRC中高表達(dá)起到促癌作用，并且可能是潛在的治療靶點(diǎn)。該文于2021年8月發(fā)表于《Molecular Therapy》IF:11.454雜志上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、ITGB8-AS1是CRC生長(zhǎng)和遷移所必須的

作者在HCT116和DLD-1細(xì)胞系中敲除ITGB8-AS1后，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)細(xì)胞系的增殖和集落形成，以及細(xì)胞的遷移。在體內(nèi)，敲除ITGB8-AS1后腫瘤的生長(zhǎng)受到顯著抑制。此外，作者還構(gòu)建了ITGB8-AS1過(guò)表達(dá)載體驗(yàn)證ITGB8-AS1對(duì)腫瘤的影響，實(shí)驗(yàn)證明ITGB8-AS1是CRC生長(zhǎng)和遷移所必須的。

2、在CRC中ITGB8-AS1正調(diào)控Focal黏附信號(hào)通路

作者對(duì)ITGB8-AS1敲除的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，挖掘差異表達(dá)基因，并對(duì)其進(jìn)行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集與Focal黏附信號(hào)通路。如圖1，作者使用WB檢測(cè)了該通路中的幾個(gè)關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)敲除ITGB8-AS1后兩個(gè)細(xì)胞系中他們的表達(dá)或磷酸化都顯著下降。這些結(jié)果表明在CRC中ITGB8-AS1正調(diào)控Focal黏附信號(hào)通路。

圖1 ITGB8-AS1正調(diào)控Focal黏附信號(hào)通路

3、ITGB8-AS1作為miR-33b-5p和let-7d-5p/let-7d-5p的海綿調(diào)節(jié)整合素的表達(dá)

為了探究ITGB8-AS1調(diào)節(jié)Focal黏附信號(hào)通路的機(jī)制，作者試圖探究ITGB8-AS1的編碼潛力。如圖2所示，和ACTB不同，多核糖體譜分析表明ITGB8-AS1富集于free-RNA組分，表明其沒(méi)有編碼能力，隨后作者使用FISH分析了ITGB8-AS1的細(xì)胞質(zhì)定位，發(fā)現(xiàn)其主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。這些提示ITGB8-AS1可能以ceRNA機(jī)制發(fā)揮作用。

圖2 ITGB8-AS1在CRC細(xì)胞中的編碼潛能及亞細(xì)胞定位分析

為了驗(yàn)證ITGB8-AS1是否以ceRNA發(fā)揮作用，作者在線預(yù)測(cè)并構(gòu)建了以ITGB8-AS1為中心的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。隨后，敲除ITGB8-AS1后檢測(cè)miRNA靶向的mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明ITGA3，ITGA5和ITGB3的表達(dá)在兩個(gè)細(xì)胞系中都顯著下降，而過(guò)表達(dá)ITGB8-AS1后他們的表達(dá)都顯著升高（圖3）。值得一提的是ITGA3，ITGA5和ITGB3都是整合素家族基因。

圖3 ITGB8-AS1海綿吸附miRNA調(diào)控整合素的表達(dá)

為了進(jìn)一步確定哪些miRNA在連接ITGB8-AS1和整合素基因中起作用，作者在HCT116細(xì)胞中進(jìn)行挽救試驗(yàn)。如圖4所示，miR-33b-5p抑制劑可以顯著挽救因ITGB8-AS1敲除導(dǎo)致的ITGA3，ITGA5和ITGB3基因表達(dá)下調(diào)，而其余的miRNA抑制劑則不行。此外，RIP結(jié)果表明ITGB8-AS1顯著富集于AGO2蛋白蛋白復(fù)合物中，而雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明ITGB8-AS1和miR-33b-5p，以及let-7c-5p/let-7d-5p之間存在直接作用。以上表明ITGB8-AS1可以海綿吸附miR-33b-5p和let-7c-5p/let-7d-5p以調(diào)節(jié)ITGA3和ITGB3的表達(dá)進(jìn)而作用于CRC的進(jìn)展。圖5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一結(jié)論。

圖4 ITGB8-AS1/miRNA/integrins的ceRNA網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證

圖5 ITGB8-AS1海綿吸附miR-33b-5p和let-7c-5p/let-7d-5p促進(jìn)CRC生長(zhǎng)遷移

4、ITGB8-AS1可作為CRC的潛在診斷和預(yù)測(cè)biomarker

使用GEPIA在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了ITGB8-AS1在結(jié)腸癌和直腸腺癌中的表達(dá)，結(jié)果顯示ITGB8-AS1在腫瘤樣本中高表達(dá)。隨后作者檢測(cè)了14對(duì)術(shù)后CRC組織和對(duì)應(yīng)的癌旁中ITGB8-AS1的表達(dá)，同樣是癌組織高于癌旁。為了探究ITGB8-AS1在液體活檢中的作用，作者檢測(cè)了7例健康對(duì)照和CRC患者血漿中ITGB8-AS1的表達(dá)，得出了一樣的結(jié)果。此外，在一個(gè)獨(dú)立隊(duì)列結(jié)果中，血漿ITGB8-AS1水平與腫瘤分化顯著正相關(guān)。III期和IV期患者血漿ITGB8-AS1水平均高于I-II期患者。淋巴結(jié)受累者易出現(xiàn)高ITGB8-AS1血漿水平，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而年齡、性別、原發(fā)腫瘤位置和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移與則ITGB8-AS1的血漿水平無(wú)關(guān)。ITGB8-AS1的血漿水平還與其靶基因表達(dá)表現(xiàn)出正相關(guān)性。這些結(jié)果表明ITGB8-AS1可作為CRC的診斷和預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。

圖6 ITGB8-AS1可作為CRC的潛在診斷和預(yù)測(cè)biomarker

5、ITGB8-AS1是治療CRC的潛在靶點(diǎn)

如前文所述，ITGB8-AS1在CRC中上調(diào)并促進(jìn)CRC的惡性行為，這為針對(duì)該lncRNA的治療提供了理論依據(jù)。為了探索ITGB8-AS1抑制的治療潛力，針對(duì)ITGB8-AS1的反義寡核苷酸(ASO)被應(yīng)用于各種CRC臨床前模型，包括患者來(lái)源的異種移植(PDX)。如圖7a-c所示，ITGB8-AS1-ASO顯著抑制細(xì)胞的增殖和集落形成。為了驗(yàn)證在體內(nèi)靶向ITGB8-AS1的活性，進(jìn)行PDX和HCT116來(lái)源的異種移植。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITGB8-AS1-ASO的抗腫瘤效率在CRC PDX和HCT116細(xì)胞負(fù)荷的小鼠中都可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)（圖7d-e），同樣也可以抑制腫瘤的肝轉(zhuǎn)移，并且miR-33b-5p，let-7c-5p和let-7d-5p抑制劑都可以緩解ITGB8-AS1-ASO的抗腫瘤效果（圖7f-g）。因此，ITGB8-AS1可以作為靶向治療CRC的新靶點(diǎn)，而ASO似乎是一種有潛力的治療方式。

圖7 ITGB8-AS1是CRC潛在的治療靶點(diǎn)

圖8本研究的機(jī)制模型圖


ITGB8-AS1通過(guò)吸附miR-33b-5p來(lái)調(diào)節(jié)ITGA3的表達(dá)，同時(shí)通過(guò)let-7c-5p和let-7d-5p來(lái)調(diào)節(jié)ITGB3的表達(dá)，然后激活整合素介導(dǎo)的Focal粘附信號(hào)。ITGB8-AS1可作為CRC患者新的治療靶點(diǎn)和循環(huán)生物標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)：

Lin X, Zhuang S, Chen X, Du J, Zhong L, Ding J, Wang L, Yi J, Hu G, Tang G, Luo X, Liu W, Ye F, LncRNA ITGB8-AS1 functions as a ceRNA to promote colorectal cancer growth and migration through integrin-mediated focal adhesion signaling, Molecular Therapy (2021), doi: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2021.08.011.