整合單細胞RNA測序與空間轉錄組學揭示間質性膀胱炎的免疫景觀

間質性膀胱炎（IC）是一種以劇烈的盆腔疼痛和泌尿系統(tǒng)癥狀為特征的膀胱疼痛綜合征，是一種嚴重的慢性疾病。目前，IC的病因和病理生理仍不清楚，診斷困難，治療困難。因此，迫切需要了解IC發(fā)生發(fā)展的分子機制，找到有效的治療靶點。最近，有研究通過scRNA-Seq結合CyTOF對CD45+單細胞進行了全面的表型和功能研究。然后，通過多模態(tài)交集分析，將scRNA-Seq獲得的免疫觀點與空間轉錄組（ST）的結果整合，揭示了IC患者膀胱的免疫景觀。該研究發(fā)表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》，IF：38.104。

技術路線：

主要結果：

1. IC膀胱CD45+免疫細胞的單細胞轉錄譜

為了破譯和構建IC的免疫圖譜，作者使用scRNA-seq來檢測IC和健康志愿者膀胱的轉錄組異質性（圖1a）。病理特征顯示IC膀胱較對照組：尿路上皮剝蝕或解剖喪失、血管生成、免疫細胞浸潤（圖1b）。IC患者和對照組的膀胱標本新鮮采集，解剖，消化成單個細胞，共分離出135,091個CD45+免疫單細胞并進行測序。經(jīng)過嚴格的質量控制，共獲得了92,029個優(yōu)質CD45+免疫細胞（圖1c）。細胞計數(shù)與基因之間有較高的相關系數(shù)（R = 0.8995），而與線粒體基因之間沒有相關系數(shù)（R =?0.006）（圖1d）。檢測到7種具有最明顯的造血和組織譜系定義基因的細胞類型，包括T細胞、B細胞、髓細胞、成纖維細胞、上皮細胞、NK細胞和內皮細胞 （圖1e-h）。去除雙聯(lián)細胞后，當前的細胞景觀由94.42%的CD45+免疫細胞和5.58%的CD45 -單細胞組成（圖1h）。

圖1 scRNA-seq和空間轉錄組學（ST）工作流程概述

2. T和B細胞譜系的逐步聚類發(fā)現(xiàn)CD8+ T細胞功能障礙和B細胞異?；罨?/span>

為了表征IC組和對照組之間單個T細胞亞群的變化，作者將T細胞亞群化，并根據(jù)經(jīng)典T細胞標志物的表達獲得9個亞群：即5個CD4+ T細胞簇、3個CD8+ T細胞簇和1個NKT細胞簇（圖2a）。在CD4+ T細胞中，通過獨特的轉錄因子和marker的表達，發(fā)現(xiàn)了2個輔助T細胞簇，包括Tregs和濾泡輔助T細胞（Tfh）（圖2b），還發(fā)現(xiàn)了IL-10，在treg中幾乎檢測不到，這可能意味著IC組免疫調節(jié)紊亂。通過高表達CCL5、CXCR6和PRDM1識別效應性記憶性CD4+ T細胞（CD4+ Tem），通過表達IL-7R、CCR7和SELL識別中樞記憶性CD4+ T細胞（CD4+ Tcm）。CD69和ICOS在這些簇中上調，提示這些細胞更可能是中樞記憶性CD4+ T細胞而不是初始T細胞。TCF7和KLF2的表達表明早期中樞記憶性T細胞表型（圖2b）。對T細胞亞群比例的分析表明，IC膀胱中treg細胞顯著增加，Th17細胞顯著減少（圖2c）。對IC組與對照組相比的差異表達基因（DEGs）進行GO和KEGG富集分析。treg的DEGs主要富集在mRNA分解代謝過程、病毒受體和黏著斑（圖2d）。而Th17細胞的DEGs主要富集在經(jīng)典的炎癥信號通路，如IL-17信號通路和NF-κB信號通路（圖2e）。CD8A和細胞毒基因（GZMA、GZMK、GZMB、NKG7和PRF1）高表達，鑒定出兩個CD8+效應T細胞簇（CD8+ Tef）。CD8+ Tef細胞高表達細胞毒標志物，GZMK+ CD8+ T細胞簇中GZMK表達水平最高，GZMA和GZMB表達水平較低。活化的CD8+ T細胞表達活化基因（如TRAC、TRBC1和ACTB），但其細胞毒性活性水平相對較低（圖2a、b）。CD8+ T細胞的耗竭marker用NR4A2, ISG20, TANK和CAPZB表示。IC組衰竭基因表達水平相對高于對照組（圖2f, g），提示CD8+ T在該慢性疾病中存在功能障礙。為了進一步研究B細胞亞群的轉錄變化，將B細胞亞群分為6個B細胞亞群（圖2h），包括初始B細胞、過渡性B細胞（tbc）、活化B細胞、未轉換的記憶B細胞（USMB）、轉換后的記憶B細胞（SMB）和漿細胞 （圖2i）。活化B細胞和USMB顯著增加，SMB和TBC減少（圖2J）。IC組B細胞以活化B細胞為主（46.32%），提示IC組B細胞活化程度逐漸加重。衰老相關基因的表達水平在IC組和對照組之間無顯著差異（圖2k）。B細胞的異常激活和漿細胞的鑒定提示IC患者可能會發(fā)生強烈的體液免疫反應。因此，檢測患者和對照者血漿、尿液中的免疫球蛋白IgA、IgM、IgG、IgE。雖然兩組之間血漿中所有免疫球蛋白的含量沒有統(tǒng)計學差異，但IC患者尿液中發(fā)現(xiàn)IgE顯著增加（圖2l），提示IgE可能是IC的一個潛在的尿液生物標志物。

圖2 T細胞和B細胞聚焦分析

3.骨髓細胞簇的分類和注釋顯示為免疫相關的巨噬細胞

作者描述了髓系細胞的分子和功能差異，共鑒定出6種細胞類型，包括中性粒細胞、炎癥性CD14+巨噬細胞、M2樣巨噬細胞、傳統(tǒng)樹突狀細胞（CDC）、漿細胞樣樹突狀細胞（PDC）和肥大細胞 （圖3A）。IC膀胱中的大多數(shù)髓系細胞是中性粒細胞（51.20%），而不是肥大細胞（圖3B）。與對照組相比，IC組中性粒細胞中DEGS的KEGG分析顯示，在抗原處理和呈遞以及類風濕關節(jié)炎通路中顯著富集（圖3C）。擬時分析描繪了從CD14+巨噬細胞到M2樣巨噬細胞的主流發(fā)展軌跡（圖3D, E）。在分化過程中，促炎基因（IL-1Β、S100A8和NLRP3）在CD14+巨噬細胞中表達上調，但隨著時間的推移逐漸下調。同時，吞噬基因和調節(jié)受體（CD163、FOLR2、STAB1、C1QA和MSR1）在M2樣巨噬細胞中逐漸上調（圖3F）。與對照組相比，炎性CD14+巨噬細胞的功能與炎癥產(chǎn)生有關 （圖3g）。然而，m2樣巨噬細胞主要通過MHC-II類分子調節(jié)免疫（圖3h）。此外，m2樣巨噬細胞的DEGs主要富集于自身免疫性疾病 （圖3i）。為了驗證兩種不同巨噬細胞的存在，對CD68、S100A8和CD163進行了免疫熒光染色（圖3j）。

圖3聚焦分析骨髓細胞

4. 用CyTOF證實免疫表型異質性

對IC患者膀胱內的免疫亞群進行了CyTOF表征，并驗證了scRNA-seq結果（圖4a）。每個聚類中所選標記的蛋白水平如圖4b所示。圖4b, c顯示了IC患者和對照組的40個聚類。對CD45+免疫細胞進行CyTOF分析（圖4d）。根據(jù)經(jīng)典標志物，確定了不同的細胞亞群，包括CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、B細胞、巨噬細胞、DCs、肥大細胞和活化細胞，推測的細胞類型與scRNA-seq的結果一致（圖4e）。這些數(shù)據(jù)有助于驗證和構建IC膀胱中的細胞免疫細胞圖譜。

圖4細胞質量分析（Mass cytometry, CyTOF）證實IC膀胱免疫細胞表型異質性

5. IC的免疫激活網(wǎng)絡

為了確定IC組中細胞激活之間的潛在相互作用，作者分析了相應的受體和配體的表達模式。相互作用對主要分布在內皮細胞、巨噬細胞、CDC和效應性記憶性CD4+ T細胞的表面（圖5a）。基于IC組中top50交互對的免疫激活網(wǎng)絡如圖5b所示。兩個趨化因子受體在幾乎所有細胞亞群中都有表達，但它們的配體主要在成纖維細胞中表達（圖5c和補充圖4b）。這些結果提示上皮細胞和成纖維細胞可能協(xié)調免疫細胞在IC膀胱中的轉移。炎癥因子（TNF, IFNG和IL-1β）的高表達水平表明IC膀胱內存在穩(wěn)健的炎癥反應（圖5d）。此外，趨化因子CCL5在幾乎所有類型的細胞中均上調。ELISA檢測證實尿液中CCL5水平高，但血液中無CCL5水平高（圖5e），因此CCL5可能是IC的尿液生物標志物。此外，IC膀胱中Treg細胞中IL-10和IL-35的表達降低（圖5f），TGF-β信號通路的表達上調（圖5g），提示IC膀胱中Treg細胞功能障礙。再加上CD8+ T耗竭，這些結果可能提示IC組存在免疫調節(jié)功能障礙，這可能導致持續(xù)的炎癥和纖維化。IC患者上皮細胞的DEGs除了參與免疫應答外，還富集于人乳頭瘤病毒感染、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用（圖5h）。在成纖維細胞的富集分析中獲得了類似的結果（圖5i）。對IC膀胱上皮細胞的前5個轉錄因子進行了預測，包括NR2F1、FOXA1、HOXD1、TBX2和OVOL1（圖5j）。對于比例變化較大的細胞類型（Tregs、Th17、Act b、SMB、USMB和中性粒細胞），回顧了這些細胞中DEGs的功能結果，發(fā)現(xiàn)它們都與病毒感染相關（圖5k）。因此，收集了20例IC患者和14例對照者的尿液標本進行病毒檢測。人多瘤病毒-2在IC尿液中檢出陽性率為95%（19/20），而在對照組尿液中未檢出（圖5l）。這一發(fā)現(xiàn)將為IC的病因學和病理生理機制提供新的線索和理論依據(jù)，今后還需要更多的工作和研究來深入研究感染的細胞類型及其關鍵受體，從而找到治療IC的潛在靶點。

圖5基于scRNA-seq的Cellphone DB分析顯示了免疫網(wǎng)絡中的串擾

6. ST顯示IC尿路上皮內有免疫細胞聚集阻斷劑在卵巢癌發(fā)生中的作用

為了生成組織切片的無偏倚轉錄組圖，將來自3例IC患者的6個膀胱組織樣本和來自對照組的3個樣本安裝在空間條形碼ST芯片載玻片上。切片經(jīng)H&E染色及brightfield成像，觀察其組織學特征。經(jīng)過標準質量控制后，采用Seurat方法進行降維，并通過T-SNE實現(xiàn)可視化。根據(jù)每個簇中的DEGs，進行逐步細胞聚類構建ST圖。圖6a展示了IC膀胱的第一個ST圖?；蚝蚒MIs之間有很強的相關性（圖6b）。檢測了平滑肌細胞（SMCs）、尿路上皮細胞、肌成纖維細胞、間質細胞（ISCs）和肥大細胞（KIT）的標記基因（圖6c）。圖6d描繪了完整的膀胱壁結構，包括尿路上皮區(qū)、固有層和肌肉層（圖6d）。FN1、TGF-β1、COL1A1和COL3A1在內的纖維化基因在各種細胞類型中均高表達，這可能表明膀胱結構可能最終發(fā)生重度纖維化（圖6e）。圖6g顯示對照膀胱的第一個ST圖?；蚝蚒MIs之間的相關系數(shù)為0.98（圖6h）。鑒定了平滑肌細胞、ISCs、成纖維細胞（COL1A2）、肌成纖維細胞和尿路上皮細胞（圖6i, j）。然而，在對照組細胞中，纖維化基因的表達水平較低（圖6k）。

圖6利用多模態(tài)交叉分析（MIA）繪制IC膀胱切片不同免疫群體的分布圖

7.免疫亞群圖譜揭示了IC和對照膀胱組織中免疫細胞的分布差異

為了精確定位免疫細胞在IC膀胱中的位置，應用多模態(tài)交集分析（MIA）來解釋不同組織之間的空間限制性映射。結果顯示，幾乎所有的免疫亞群，如巨噬細胞、調節(jié)性T細胞、駐留記憶CD8+ T細胞、漿細胞、PDC、CDCS、NKT細胞、初始B細胞和中性粒細胞，在IC膀胱的尿路上皮區(qū)域富集或位于成纖維細胞附近（圖6f），也在對照膀胱的尿路上皮和平滑肌細胞周圍發(fā)現(xiàn)（圖6l）。但其中只有一半的免疫細胞亞群在對照膀胱的尿路上皮區(qū)域被識別。MIA的研究結果證實了上皮細胞和成纖維細胞在IC的發(fā)生發(fā)展中的重要作用，CellPhone DB數(shù)據(jù)庫也提示了這一點。綜上所述，作者成功構建了IC膀胱在空間水平上的免疫圖譜，并表征了IC膀胱的免疫網(wǎng)絡。

結論：

作者構建了女性IC患者膀胱的免疫景觀，確定了這些免疫細胞亞群的特征，并闡述了它們之間的關系和相互作用。該研究為IC的免疫圖譜研究開創(chuàng)了先例。免疫系統(tǒng)的研究可能會對IC的病理生理機制提供更深入的了解，并為未來該病的診斷和治療奠定基礎。

參考文獻：

Peng L, Jin X, Li BY, Zeng X, Liao BH, Jin T, Chen JW, Gao XS, Wang W, He Q, Chen G, Gong LN, Shen H, Wang KJ, Li H, Luo DY. Integrating single-cell RNA sequencing with spatial transcriptomics reveals immune landscape for interstitial cystitis. Signal Transduct Target Ther. 2022; 7(1):161. doi: 10.1038/s41392-022-00962-8.