MYC介導(dǎo)的PDAC對(duì)曲美替尼和HCQ的耐藥性可通過(guò)CDK4/6和溶酶體抑制來(lái)克服

KRAS>RAF>MEK1/2>ERK1/2信號(hào)通路的藥理抑制對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)患者沒(méi)有臨床益處。聯(lián)合抑制MEK1/2(使用曲美替尼[T])和自噬(使用氯喹[CQ]或羥氯喹[HCQ])在臨床前模型和患者(患者1)中顯示出顯著的抗腫瘤作用。然而并非所有患者對(duì)T/HCQ方案有反應(yīng)，患者1最終發(fā)展為耐藥疾病。我們報(bào)告了原發(fā)性或獲得性耐藥與圍繞c-MYC的局灶性DNA拷貝數(shù)增加有關(guān)。c-MYC在PDAC細(xì)胞系中的異位表達(dá)使其具有T/HCQ抗性。CDK4/6抑制劑palbociclib (P)也誘導(dǎo)自噬并覆蓋c-MYC介導(dǎo)的T/HCQ耐藥，因此P/HCQ促進(jìn)了T/HCQ耐藥PDAC腫瘤的消退，c-MYC表達(dá)升高?；颊?的P/HCQ治療導(dǎo)致生化疾病反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)表明，c-MYC表達(dá)升高既是T/HCQ抗性的標(biāo)志，也是一種中介，這種抗性可以通過(guò)使用P/HCQ來(lái)克服。本文于2023年3月發(fā)表于Journal of Experimental Medicine(IF=17.579)。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

(1) 在對(duì)曲美替尼+HCQ顯示先天或獲得性耐藥的PDACs中檢測(cè)到c-MYC表達(dá)升高

我們先前報(bào)道了一例PDAC轉(zhuǎn)移性疾病患者(患者1)在曲美替尼(2mg/d)聯(lián)合HCQ治療(1200mg/d, T₂/HCQ₁₂₀₀)?；诿枋?/span>T/HCQ抗腫瘤作用和患者1的癥狀的臨床前數(shù)據(jù)，我們治療了第二名患者(患者2)，其疾病也在所有標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理PDAC治療中進(jìn)展(圖1A)。患者2接受了曲美替尼(2mg/d)+HCQ (400mg/d; T₂/HCQ₄₀₀)降至800 mg/d，然后降至1200 mg/d (T₂/HCQ₁₂₀₀)，以使?jié)撛诘亩拘宰兊妹黠@并減輕?；颊?/span>2的CA19-9水平持續(xù)上升(圖1A)，在T₂/HCQ₁₂₀₀治療2個(gè)月后，計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)成像顯示，疾病進(jìn)展與T/HCQ治療的內(nèi)在耐藥性一致(圖1B)。患者1最初對(duì)T₂/HCQ₁₂₀₀治療有反應(yīng)，最終獲得耐藥，CT成像顯示CA19-9水平升高和疾病進(jìn)展(圖1C, D)。隨后對(duì)T/HCQ耐藥肺轉(zhuǎn)移進(jìn)行活檢，進(jìn)行(1)免疫組化(IHC)分析，(2)生成患者來(lái)源的異種移植(PDX)，以及(3)分析軀體腫瘤DNA。這種轉(zhuǎn)移也表現(xiàn)出圍繞c-MYC的局灶性拷貝數(shù)增加。免疫組化分析顯示，相對(duì)于患者1初次手術(shù)切除時(shí)獲得的原發(fā)病灶，T/HCQ耐藥轉(zhuǎn)移灶中c-MYC表達(dá)升高(圖1E)。在T/HCQ治療前采集的肝轉(zhuǎn)移活檢組織分析發(fā)現(xiàn)，第三例患者(患者3)也患有T/HCQ耐藥疾病(圖1F, G)。綜合這些數(shù)據(jù)，提示c-MYC升高與T/HCQ耐藥之間存在相關(guān)性。

圖1：c-MYC表達(dá)在對(duì)T/HCQ表現(xiàn)出先天或后天抗性的PDACs中升高

(2) c-MYC使PDAC對(duì)曲美替尼聯(lián)合CQ治療產(chǎn)生耐藥性

突變激活的KRAS通過(guò)其典型效應(yīng)物RAF和PI3K提高c-MYC的表達(dá)。相反，在一些PDAC模型中，MAPK信號(hào)通路的抑制可抑制c-MYC的表達(dá)。為了測(cè)試c-MYC表達(dá)的升高是否會(huì)使PDAC細(xì)胞對(duì)T/HCQ產(chǎn)生抗性，我們?cè)O(shè)計(jì)了PDAC細(xì)胞系，有條件地表達(dá)c-MYC^WT或c-MYC^T58A，后者是c-MYC的穩(wěn)定形式。強(qiáng)力霉素(Dox)治療導(dǎo)致c-MYC表達(dá)相對(duì)內(nèi)源性蛋白增加約2-5倍(圖2A, C)。向T/CQ處理的細(xì)胞中添加Dox可使c-MYC表達(dá)恢復(fù)到對(duì)照水平的0.7-2.2倍(圖3C定量)。為了評(píng)估異位c-MYC表達(dá)是否介導(dǎo)體內(nèi)對(duì)T/CQ的耐藥性，將表達(dá)Tet-On c-MYC的HPAF-II或PDX220細(xì)胞移植到NOD/SCID小鼠中。當(dāng)給荷瘤小鼠喂食對(duì)照飼料(?Dox)時(shí)，T/CQ治療顯示腫瘤停滯或消退，c-MYC^WT的異位表達(dá)(圖2A, C)或c-MYC^T58A在喂食含有Dox的(+Dox)飼料的小鼠中，腫瘤對(duì)T/CQ治療產(chǎn)生耐藥性。當(dāng)用T/CQ治療的小鼠被喂食Dox飼料以誘導(dǎo)最初對(duì)T/CQ治療有反應(yīng)的腫瘤中的c-MYC表達(dá)時(shí)，觀察到腫瘤再生，這表明c-MYC表達(dá)可以介導(dǎo)獲得性T/HCQ耐藥。相反，從最初耐藥疾病的小鼠中去除Dox飼料導(dǎo)致腫瘤消退，這表明減少c-MYC表達(dá)可使腫瘤對(duì)T/CQ治療敏感。T/CQ治療組腫瘤的c-MYC和pERK降低，而與Dox聯(lián)合治療則恢復(fù)了c-MYC的表達(dá)(圖2B, D)。

我們假設(shè)，T/CQ耐藥細(xì)胞中c-MYC表達(dá)的降低可能會(huì)使這些細(xì)胞對(duì)T/CQ治療敏感。極光激酶A (AURKA)的抑制劑，如alisertib，通過(guò)取消AURKA與c-MYC結(jié)合時(shí)對(duì)FBW7介導(dǎo)的蛋白酶體降解的保護(hù)來(lái)破壞c-MYC的穩(wěn)定。alisertib治療PANC-1細(xì)胞可降低c-MYC的表達(dá)，加入曲美替尼可進(jìn)一步增強(qiáng)c-MYC的表達(dá)(圖2E)。用(1)載體，(2)T/CQ組合，(3)單獨(dú)alisertib，或(4)alisertib+T/CQ治療小鼠攜帶的PANC-1腫瘤。PANC-1腫瘤對(duì)T/CQ聯(lián)合或alisertib單藥治療有耐藥性。然而，alisertib加T/CQ可引起腫瘤消退，這表明通過(guò)AURKA阻斷降低c-MYC表達(dá)可使T/CQ治療敏感。T/CQ和alisertib治療組腫瘤的c-MYC表達(dá)減少，但在alisertib+T/CQ治療組檢測(cè)到c-MYC的額外減少(圖2F)。曲美替尼治療導(dǎo)致pERK1/2減少，而CQ治療導(dǎo)致p62SQSTM1增加。這些研究表明，c-MYC表達(dá)升高對(duì)T/CQ治療具有耐藥性，降低c-MYC表達(dá)可能會(huì)增加T/CQ耐藥疾病的敏感性。

圖2：c-MYC檢測(cè)異種移植胰腺腫瘤對(duì)T/CQ的敏感性

圖3：c-MYC表達(dá)升高可阻止T/CQ介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯

(3)在曲美替尼+CQ聯(lián)合治療時(shí)，c-MYC促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展

為了探索c-MYC如何介導(dǎo)對(duì)T/CQ的耐藥性，我們檢測(cè)了細(xì)胞分裂周期，這是由激活的KRAS和c-MYC調(diào)節(jié)的癌癥的標(biāo)志之一。為了測(cè)試c-MYC表達(dá)升高是否會(huì)覆蓋T/cq誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯，我們分析了PDAC細(xì)胞系在不存在(-Dox)或存在(+Dox)異位c-MYC時(shí)的細(xì)胞周期階段。與對(duì)照組相比，c-MYC表達(dá)增加了處于S期或G2/M期的細(xì)胞百分比，在異位c-MYC表達(dá)7 d后，S期明顯增加了約5-10%(圖3A, B)。T/CQ處理降低了S期或G2/M期的細(xì)胞百分比，但c-MYC^WT的表達(dá)(圖3A, B)或c-MYC^T58A(補(bǔ)充圖未展示)克服了這種細(xì)胞周期阻滯，并將S期細(xì)胞的百分比恢復(fù)到控制水平。這些結(jié)果表明c-MYC的過(guò)表達(dá)在體外克服了T/CQ處理后發(fā)生的細(xì)胞周期阻滯。

為了表征c-MYC表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期機(jī)制的影響，我們對(duì)c-MYC轉(zhuǎn)錄控制的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子進(jìn)行了免疫印跡分析。c-MYC^WT表達(dá)對(duì)周期蛋白或CDKs(周期蛋白依賴激酶；圖3C)，但c-MYC^T58A增加了HPAF-II和Panc 10.05細(xì)胞中cyclins A2和B1的表達(dá)(補(bǔ)充圖未展示)。c-MYC^T58A的表達(dá)是內(nèi)源性c-MYC的8-12倍，而異位c-MYC^WT的表達(dá)是內(nèi)源性c-MYC的2-5倍，這可能解釋了c-MYC^T58A對(duì)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的差異影響。隨著時(shí)間推移，c-MYC^T58A調(diào)節(jié)c-MYC靶基因的能力可能發(fā)生改變。c-MYC^WT表達(dá)導(dǎo)致p27^KIP1表達(dá)降低(圖3C)。T和T/CQ處理均降低了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(RB)磷酸化和RB、E2F1、A-、B-、D-和E型周期蛋白、CDK2、4和6以及p21^CIP1的總表達(dá)(圖3C)。在曲美替尼或T/CQ處理的PDAC細(xì)胞中，c-MYC^WT或c-MYC^T58A的表達(dá)引發(fā)了RB磷酸化(圖3C)。c-MYC并沒(méi)有誘導(dǎo)CDK2或cyclin E1的表達(dá)。曲美替尼或T/CQ處理的細(xì)胞中c-MYC的表達(dá)增加了cyclins A2和B1的表達(dá)。在細(xì)胞周期的最小模型中，細(xì)胞周期蛋白A2和B1對(duì)于細(xì)胞周期的完成至關(guān)重要，而周期蛋白A是促進(jìn)肺細(xì)胞系中c-MYC驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)展的主要周期蛋白。這些發(fā)現(xiàn)表明，c-MYC介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白A2和B1、RB失活和p27^KIP1減少的作用足以促進(jìn)T/CQ存在時(shí)的細(xì)胞周期進(jìn)展。這些數(shù)據(jù)表明誘導(dǎo)的c-MYC表達(dá)覆蓋T/CQ誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯。

(4) 藥物抑制CDK4/6誘導(dǎo)PDAC細(xì)胞系自噬

KRAS調(diào)控的下游信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控D型周期蛋白及其伙伴CDK4和CDK6 (CDK4/6)促進(jìn)G₀>G₁>S期細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變。我們?cè)u(píng)估了CDK4/6抑制劑在PDAC細(xì)胞系中調(diào)節(jié)自噬的能力。細(xì)胞周期阻滯和自噬誘導(dǎo)有關(guān)聯(lián)。為了確定CDK4/6抑制是否調(diào)節(jié)自噬，我們用palbociclib處理了四種表達(dá)mCherry-eGFP-LC3B自噬通量報(bào)告(AFR)的PDAC細(xì)胞系(圖4A, B)，并觀察了與對(duì)照組相比的自噬誘導(dǎo)。為了測(cè)試自噬是否由CDK4/6抑制而非palbociclib的脫靶效應(yīng)誘導(dǎo)，PDAC細(xì)胞使用額外的CDK4/6抑制劑(abemaciclib或ribociclib)處理，再次誘導(dǎo)自噬(圖4C)。與DMSO對(duì)照相比，palbociclib、ribociclib或trametinib處理的活的MIA-PaCa2^AFR細(xì)胞的熒光圖像顯示eGFP陽(yáng)性斑點(diǎn)的預(yù)期減少(圖4D)。palbociclib、abemaciclib或ribociclib對(duì)CDK4/6的抑制導(dǎo)致酸性細(xì)胞器增加(圖4F, G)，其程度與曲美替尼或Earle’s平衡鹽溶液(EBSS；饑餓控制)類似。為了進(jìn)一步表征這些細(xì)胞器，我們進(jìn)行了電子顯微鏡觀察，用palbociclib或abemaciclib處理導(dǎo)致單膜和/或雙膜自噬囊泡的大小顯著增加(圖4H, I)。雖然阿貝西庫(kù)治療導(dǎo)致囊泡數(shù)量顯著增加，但帕博西庫(kù)和曲美替尼治療沒(méi)有。CQ介導(dǎo)的溶酶體-自噬體融合抑制了Panc 10.05^AFR和MIA-PaCa2^AFR細(xì)胞中palbociclil誘導(dǎo)的自噬(圖4E)。

圖4：CDK4/6抑制誘導(dǎo)人PDAC系自噬

(5) 帕博西尼聯(lián)合CQ可延緩PDAC體外生長(zhǎng)

為了確定CDK4/6聯(lián)合溶酶體抑制是否會(huì)阻止細(xì)胞增殖，我們使用(1)DMSO，(2) palbociclib，(3) CQ或(4)P/CQ處理的細(xì)胞進(jìn)行了體外生長(zhǎng)測(cè)定。與對(duì)照組相比，P/CQ表現(xiàn)出顯著的協(xié)同抗增殖作用(圖5A)。與對(duì)照組相比，CQ+ribociclib或abemaciclib處理MIA-PaCa2細(xì)胞再次產(chǎn)生顯著的抗增殖作用(圖5B, C)。

用曲美替尼治療PDAC細(xì)胞可增加G0/G1期細(xì)胞的比例；然而添加CQ沒(méi)有進(jìn)一步的影響(補(bǔ)充圖未展示)。為了確定在palbociclib中添加CQ是否對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程有進(jìn)一步的影響，我們用palbociclib或P/CQ處理MIA-PaCa2、PDX220和HPAF-II細(xì)胞(補(bǔ)充圖未展示)。與我們觀察到的T/CQ相似，帕博西利加入CQ并沒(méi)有增加G0/G1期的細(xì)胞比例。

為了確定P/CQ處理是否導(dǎo)致細(xì)胞死亡，我們?cè)u(píng)估了caspase 3/7活性。雖然在MIAPaCa2細(xì)胞中，對(duì)照組和聯(lián)合組之間沒(méi)有差異，但P/CQ處理的Panc 10.05細(xì)胞中caspase 3/7活性增加(補(bǔ)充圖未展示)。這些數(shù)據(jù)表明，自噬是一種保護(hù)機(jī)制，在CDK4/6抑制時(shí)促進(jìn)PDAC細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖5：c-MYC表達(dá)升高不能阻止P/CQ介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯

(6) 帕博西尼加CQ可以阻止c-MYC介導(dǎo)的細(xì)胞周期進(jìn)程

鑒于c-MYC能夠克服曲美替尼或T/CQ誘導(dǎo)的增殖阻滯，我們測(cè)試了c-MYC表達(dá)升高的細(xì)胞是否對(duì)CDK4/6抑制敏感。與對(duì)照相比，palbociclib和P/CQ誘導(dǎo)了顯著的細(xì)胞周期阻滯(補(bǔ)充圖未展示)。c-MYC^WT或c-MYC^T58A的異位表達(dá)未能克服palbociclib或P/CQ介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯(圖5D)。雖然P/CQ和T/CQ處理對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的表達(dá)產(chǎn)生了類似的影響，但c-MYC^WT或c-MYC^T58A的異位表達(dá)未能促進(jìn)RB磷酸化或誘導(dǎo)P/CQ后細(xì)胞周期蛋白A2或B1的表達(dá)(圖5E)。這些數(shù)據(jù)表明c-MYC不能克服P/CQ引起的細(xì)胞周期阻滯。

(7)帕博西尼聯(lián)合CQ可誘導(dǎo)c-MYC異位表達(dá)的PDAC的腫瘤停滯

為了確定P/CQ治療是否可以在有或沒(méi)有c-MYC表達(dá)的情況下阻止PDAC腫瘤生長(zhǎng)，將小鼠移植到Tet-On表達(dá)c-MYC的HPAF-II或PDX220細(xì)胞(圖6A, C)，并用(1)載體(對(duì)照)，(2)Dox誘導(dǎo)c-MYC表達(dá)(Dox)，(3) palbociclib (P，僅在PDX220中)，(4)P/CQ，或(5)Dox+P/CQ (D/P/CQ)處理。無(wú)論c-MYC表達(dá)如何，P/CQ治療均可阻止腫瘤生長(zhǎng)。免疫組化分析證實(shí)，在Dox治療的小鼠中，腫瘤生長(zhǎng)中的c-MYC表達(dá)升高，palbociclib治療時(shí)RB磷酸化降低(圖6B, D)。這些結(jié)果表明，用P/CQ治療異種移植PDAC腫瘤以c-MYC獨(dú)立的方式抑制生長(zhǎng)。

圖6：P/CQ阻止表達(dá)c-MYC升高的PDAC異種移植的生長(zhǎng)

(8) 患者1在帕博西尼+HCQ治療后顯示CA19-9腫瘤標(biāo)志物減少

在T₂/HCQ₁₂₀₀治療177 d后，患者1在CT成像上表現(xiàn)出疾病進(jìn)展的跡象，包括CA19-9增加和腫瘤大小(圖7A)。在出現(xiàn)對(duì)曲美替尼耐藥后，基于BRAF驅(qū)動(dòng)的PDAC對(duì)ulixertinib的明顯敏感性，患者1被切換到ERK1/2抑制劑(ulixertinib)+HCQ的聯(lián)合治療。然而患者無(wú)反應(yīng)。肺轉(zhuǎn)移分析顯示，與原發(fā)腫瘤相比，染色體8p包括c-MYC的拷貝數(shù)增加?；颊咄饨邮?/span>palbocilclib+HCQ治療。CA19-9水平在治療9 d后下降，并持續(xù)10 d，表明對(duì)P/HCQ有反應(yīng)(圖7A)。P/HCQ治療開(kāi)始3周后，CT成像顯示轉(zhuǎn)移性肝病灶液化性壞死(圖7B)?；颊叱霈F(xiàn)惡性高鈣血癥(HHM)，檢測(cè)顯示甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrP)升高106.0 pmol/升(正常范圍0-2.3 pmol/升)，提示腫瘤細(xì)胞裂解(補(bǔ)充圖未展示)?；颊叩?/span>HHM被成功治療。然而患者未能茁壯成長(zhǎng)，并停止了P/HCQ治療，此時(shí)他的血清CA19-9水平升高，患者選擇接受臨終關(guān)懷。

我們從NOD/SCID小鼠肺病變活檢中建立了PDX模型。免疫組化分析顯示c-MYC的表達(dá)與活檢肺病變相似(補(bǔ)充圖未展示)。為了確定患者1對(duì)P/HCQ的反應(yīng)是否由于任何單一藥物的作用，對(duì)T/HCQ耐藥腫瘤小鼠進(jìn)行(1)載體，(2)CQ，(3)曲美替尼，(4)palbociclib，(5) T/CQ，或(6)P/CQ治療?；颊?/span>1的PDX腫瘤對(duì)除P/CQ外的所有治療均耐藥(圖7C)，進(jìn)一步提示P/CQ治療對(duì)T/HCQ耐藥且c-MYC表達(dá)升高的PDAC有效。對(duì)照與藥物治療小鼠的腫瘤免疫組化分析證實(shí)(1)c-MYC表達(dá)，(2)曲美替尼治療小鼠的pERK1/2降低，(3)曲美替尼和帕博昔利治療小鼠的pRB降低，以及(4)CQ治療小鼠的p62SQSTM1升高(圖7D)。這些結(jié)果表明，帕博昔利聯(lián)合HCQ可能有效治療c-MYC介導(dǎo)的對(duì)曲美替尼和HCQ耐藥的PDAC。

圖7：患者1用P/HCQ治療導(dǎo)致CA19-9和整體腫瘤負(fù)荷減少

結(jié)論：P/HCQ治療可能是PDAC患者的另一種可能的治療方式，值得在嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)：

Silvis, M. R., Silva, D., Rohweder, R., Schuman, S., Gudipaty, S., Truong, A., Yap, J., Affolter, K., McMahon, M., & Kinsey, C. (2023). MYC-mediated resistance to trametinib and HCQ in PDAC is overcome by CDK4/6 and lysosomal inhibition. The Journal of experimental medicine, 220(3), e20221524. https://doi.org/10.1084/jem.20221524.