ERβ介導(dǎo)的circATP2B1和miR-204-3p信號(hào)軸促進(jìn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌侵襲
ERβ介導(dǎo)的circATP2B1和miR-204-3p信號(hào)軸促進(jìn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌侵襲
研究表明，雌激素受體β（ERβ）可影響透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）的進(jìn)展。 然而，ERβ調(diào)節(jié)ccRCC進(jìn)展的詳細(xì)機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。近日，河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院王曉路院長(zhǎng)團(tuán)隊(duì)發(fā)表在《Cancer Research》 (IF=9.122)上的文章《ERβ-mediated alteration of circATP2B1 and miR-204-3p signaling promotes invasion of clear cell renal cell carcinoma》報(bào)告了ERβ介導(dǎo)的ccRCC進(jìn)展的機(jī)制細(xì)節(jié)。他們發(fā)現(xiàn)，ERβ通過(guò)抑制circATP2B1的表達(dá)及通過(guò)直接結(jié)合其宿主基因ATP2B1的啟動(dòng)子區(qū)域增加ccRCC細(xì)胞侵襲。ERβ抑制circATP2B1表達(dá)導(dǎo)致miR-204-3p表達(dá)降低，纖連蛋白1（FN1）表達(dá)升高，進(jìn)一步增強(qiáng)ccRCC細(xì)胞侵襲。在ccRCC小鼠模型中用shRNA靶向抑制ERβ或過(guò)表達(dá)circATP2B1可以部分逆轉(zhuǎn)這一增強(qiáng)作用。作者還通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中ccRCC患者生存數(shù)據(jù)表明，ERβ和FN1高表達(dá)患者的總體生存率更差，而miR-204-3p高表達(dá)患者的總體生存率更高。以上研究結(jié)果表明ERβ通過(guò)改變ERβ/ circATP2B1 / miR-204-3p / FN1軸的表達(dá)促進(jìn)ccRCC細(xì)胞侵襲。
技術(shù)路線(xiàn)：
研究結(jié)果：
1. ERβ 促進(jìn)ccRCC細(xì)胞侵襲
圖1（A）Western blot方法驗(yàn)證786-O細(xì)胞中敲低的ERβ（左）和A498細(xì)胞中ERβ的過(guò)表達(dá)（右）。（B）使用ERβ-shRNA和pLKO轉(zhuǎn)染的786-O細(xì)胞（左2張圖像）和用ERβ-cDNA和pWPI轉(zhuǎn)染的A498細(xì)胞進(jìn)行腔室 - transwell侵襲測(cè)定。（C）使用ERβ-shRNA和pLKO轉(zhuǎn)染的786-O細(xì)胞（左2張圖像）和用ERβ-cDNA和pWPI轉(zhuǎn)染的A498細(xì)胞進(jìn)行3D侵襲實(shí)驗(yàn)。
2. 高表達(dá)的ERβ與ccRC預(yù)后差相關(guān)
圖2（A）基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的分析表明較高水平的ERβ與較差的存活率有關(guān)。（B-C）生存曲線(xiàn)顯示較高水平的ERβ與男性及女性RCC患者的生存率較低相關(guān)。（D）總生存率在男性和女性RCC患者中無(wú)顯著性差異。（E）基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的T分期分析顯示，RCC組織高ERβ水平與更高的癌癥分期相關(guān)。
3. ERβ通過(guò)調(diào)節(jié)circATP2B1表達(dá)增強(qiáng)RCC細(xì)胞侵襲
圖3（A）在敲減ERβ(shERβ)及空載對(duì)照(pLKO)的786-O細(xì)胞以及過(guò)表達(dá)ERβ及空載對(duì)照(pWPI)的A498細(xì)胞中采用Real-time PCR篩選一組與ccRCC相關(guān)的circRNAs。（B）Western blot在786-O細(xì)胞及Caki-1細(xì)胞驗(yàn)證shERβ#1及shERβ#2的敲減效果。（C）轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染shERβ#1/shcircATP2B1#1或shERβ#2/shcircATP2B1#2的786-O細(xì)胞的腔室 - transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。（D）轉(zhuǎn)染pLKO+pLVTHM, shERβ#2+pLVTHM, pLKO+shcircATP2B1#2, 或 shERβ#2+shcircATP2B1#2的Caki-1細(xì)胞的腔室-transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。（E）過(guò)表達(dá)ERβ (oeERβ)或過(guò)表達(dá)circATP2B1（oecircATP2B1）的A498細(xì)胞的腔室-侵襲實(shí)驗(yàn)。
4. ERβ調(diào)節(jié)circATP2B1表達(dá)的機(jī)制解讀
圖4 （A）在ATP2B1上游2kb啟動(dòng)子區(qū)域存在一個(gè)雌激素響應(yīng)元件（ERE）。（B）ChiP pull-down驗(yàn)證ERβ可以與推測(cè)的ERE結(jié)合。（C）lncRNA Hotair 啟動(dòng)子ERE作為陽(yáng)性對(duì)照，以及距APT2B1 ERE上游約500bp的（-2268nt 到-2254nt）區(qū)間作為陰性對(duì)照做ChiP分析。（D-F）雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證ATP2B1啟動(dòng)子ERE與ERβ的結(jié)合。
5. ERβ通過(guò)改變circATP2B1 / miR-204-3p增強(qiáng)RCC細(xì)胞侵襲
圖5（A）qPCR檢測(cè)在A498細(xì)胞中敲除或過(guò)表達(dá)ERβ或circATP2B1后，miRNA的表達(dá)變化。（B）RNA pull-down分析檢測(cè)circATP2B1與miRNA的結(jié)合。（C）786-O挽救實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示sh-circATP2B1可以逆轉(zhuǎn)ERβ敲減后引起的miR-204-3p的表達(dá)水平升高。（D）挽救實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示oecircATP2B1可以逆轉(zhuǎn)ERβ過(guò)表達(dá)后引起的miR-204-3p的表達(dá)水平降低。（E）circATP2B1影響miRNA-204-3p的穩(wěn)定性。（F）腔室-transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和3D侵襲實(shí)驗(yàn)分析786-O細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLKO+Ctl, shERβ#1+Ctl, pLKO+miR-204-3p inhibitor, 或shERβ#1+miR-204-3p inhibitor后的細(xì)胞侵襲情況.（G）腔室-transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和3D侵襲實(shí)驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染pWPI+pLVTHM, oeERβ+pLVTHM, pWPI+oemiR-204-3p, oeERβ+oemiR-204-3p后A498細(xì)胞的侵襲情況。
6. ERβ-circATP2B1-miR204-3p通過(guò)改變FN1信號(hào)促進(jìn)ccRCC侵襲
圖6（A）qRT-PCR分析篩選786-O細(xì)胞中與ccRCC轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。（B）qRT-PCR分析篩選A498細(xì)胞中與ccRCC轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。（C）圖表展示FN1可能是受ERβ、circATP2B1和miR-204-3p調(diào)控的RCC轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。（D）ERβ可以上調(diào)786-O和A498細(xì)胞中FN1的表達(dá)。（E）Western blot分析分別轉(zhuǎn)染pLKO+pLVTHM, shERβ#1+pLVTHM, pLKO+shcircATP2B1#1, 或 shERβ#1+shcircATP2B1#1的786-O細(xì)胞及轉(zhuǎn)染pWPI+pWPI, oeERβ+pWPI, pWPI+oecircATP2B1, or oeERβ+oecircATP2B1的A498細(xì)胞的FN1的表達(dá)水平。（F）Western blot分析分別轉(zhuǎn)染pLKO+Ctrl, shERβ#1+Ctrl, pLKO+miR-204-3p inhibitor, 或 shERβ#1+miR-204-3p inhibitor的786-O細(xì)胞及轉(zhuǎn)染pWPI+pLVTHM, oeERβ+pLVTHM, pWPI+oemiR-204-3p, or oeERβ+oemiR-204-3p的A498細(xì)胞的FN1的表達(dá)水平。（G）腔室-transwell分析及3D侵襲實(shí)驗(yàn)分析786-O細(xì)胞轉(zhuǎn)染pWPI+pLVTHM, oeERβ+pLVTHM, pWPI+shFN1, oe ERβ +shFN1后細(xì)胞侵襲情況。（H-J）數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的FN1 3’UTR與miR-204-3p靶向結(jié)合并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證。(K) 生存曲線(xiàn)驗(yàn)證高表達(dá)miR-204-3p的ccRCC患者總生存期較長(zhǎng)。（L）具有高表達(dá)FN1的RCC患者預(yù)后較差。
7. 體內(nèi)小鼠研究證實(shí)ERβ通過(guò)調(diào)節(jié)circATP2B1促進(jìn)RCC轉(zhuǎn)移
圖7 （A）IVIS圖像分析發(fā)現(xiàn)小鼠原位腫瘤模型出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。（B-E）肝、小腸、脾和左腎發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。（F）轉(zhuǎn)移定量。（G）轉(zhuǎn)移點(diǎn)定量。（H）IHC染色分析ERβ和FN1的表達(dá)。