m6A RNA甲基化測序

m6A RNA甲基化測序
     RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上最為普遍的修飾。目前發(fā)現(xiàn)microRNA，circRNA, lncRNA, rRNA, tRNA和snoRNA上都有發(fā)生m6A修飾。 m6A修飾主要發(fā)生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“編碼器(Writer)”、“消碼器(Eraser)”和“讀碼器(Reader)”決定?！熬幋a器(Writer)”即甲基轉移酶，目前已知這個復合物的成分有METTL3，METTL14, WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作為去甲基酶（消碼器）可逆轉甲基化；m6A由m6A結合蛋白識別，目前發(fā)現(xiàn)m6A結合蛋白（讀碼器）有YTH結構域蛋白（包括YTHDF1, YTHDF2,YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。在基因表達、蛋白翻譯和RNA剪切等正常生物過程中具有重要作用。近來有研究顯示m6A RNA甲基化在乳腺癌、惡性血液病、膠質母細胞瘤、宮頸癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

 
       圖 1 m6A修飾的酶系統(tǒng)               圖 2 m6A生物學功能


一、MeRIP-seq實驗流程

圖3 英拜 m⁶A RNA甲基化測序實驗流程

二、m6A甲基化測序分析內容

u  測序數(shù)據(jù)質量評估及QC

u  測序序列與參考基因組比對

u  RNA甲基化peak calling                  

u  peak在基因組中的分布及注釋

u  Peak在基因組中富集程度統(tǒng)計   

u  差異RNA甲基化區(qū)域分析

u  差異RNA甲基化區(qū)域GO與KEGG富集分析 

三、研究案例

1、m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program. Cancer Cell 2017.(IF=27.4)
    DNA甲基化異常是膠質瘤的表觀遺傳調控因子，但RNA甲基化在腫瘤包括惡性膠質瘤（GBM）中的調控還尚未清楚。為研究m6A調節(jié)可能導致GBM患者臨床療效不佳，作者通過TCGA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)ALKBH5在惡性膠質瘤樣干細胞（GSCs）中高表達且與GBM 病人不良預后相關，干擾ALKBH5  降低GSCs細胞的自我更新能力且抑制GSCs增殖，進一步體內驗證敲除ALKBH5可抑制腫瘤生長。
    為研究ALKBH5的m6A作用機制，作者利用芯片和m6A-seq篩選到膠質瘤增殖相關的FOXM1，最后通過qPCR、WB、免疫熒光、核質分離WB/qPCR、RIP和MeRIP等實驗證明ALKBH5通過去甲基化調節(jié)FOXM1在GSCs中的表達。
    為研究ALKBH5對FOXM1的作用是否受其他因子的調節(jié)，作者研究了FOXM1的鄰近基因，發(fā)現(xiàn)lncRNA FOXM1-AS與FOXM1序列互補，且共表達、共定位，進一步通過RIP, RNA pull down等實驗證明lncRNA FOXM1-AS促進ALKBH5 和FOXM1初級轉錄本的相互作用。最后通過細胞實驗進一步驗證ALKBH5在lncRNA FOXM1-AS的作用下維持FOXM1的表達和細胞增殖，從而維持GSCs的干性。

四、送樣要求

A樣品要求：

1. 樣品類型：細胞、新鮮組織或RNA樣品。

2. 樣品量：細胞樣品請?zhí)峁┲辽?×10⁷~10⁸個細胞，組織樣品請?zhí)峁┲辽?g的組織塊，RNA樣品請?zhí)峁?00μg以上的總RNA。

3. 樣品質量：RNA無明顯降解，提取的總RNA OD260/280值在1.8～2.2之間，濃度 ≥ 500ng/μl，28S:18S ≥ 1.5，RIN ≥7。

4. 樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊（切成～50mg的小塊）可用TRIZOL或RNA保護劑處理或液氮凍存后，-80℃保存。RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存。樣品保存期間避免反復凍融。

5. 樣品運輸：樣品置于1.5 ml管中，封口膜封好，干冰運輸。