CircRNA通過(guò)ceRNA機(jī)制調(diào)控自噬影響腦缺血性中風(fēng)

自從大隅良典因細(xì)胞自噬獲得2016年度諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，自噬的研究熱度持續(xù)升溫。

自噬目前根據(jù)發(fā)生過(guò)程分為三類：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA)。大自噬（Macroautophagy）即我們說(shuō)的自噬（autophagy）;微自噬（Microautophagy）：是指溶酶體主動(dòng)、直接吞噬胞漿成分的一種方式; 分子伴侶介導(dǎo)的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侶，如hsp70，能幫助未折疊蛋白轉(zhuǎn)位入溶酶體。通常說(shuō)的自噬泛指Macroautophagy.

CircRNA的研究也是近幾年開(kāi)始熱門(mén)起來(lái)的，下面讓我們通過(guò)一篇文章來(lái)介紹如何將這兩大熱門(mén)聯(lián)系起來(lái)。

該文為東南大學(xué)的姚紅紅教授團(tuán)隊(duì)于今年6月份發(fā)表在Attophagy雜志(IF=11.1)上，題為”Novel insight into circular RNA HECTD1 in astrocyte activation via autophagy by targeting MIR142-TIPARP: Implications for cerebral ischemic stroke“, 揭示circHECTD1同過(guò)ceRNA機(jī)制調(diào)控自噬，參與腦缺血中風(fēng)過(guò)程。

研究人員首先通過(guò)circRNA芯片技術(shù)在中風(fēng)小鼠模型-短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞缺血性腦組織中發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA circHECTD1顯著高表達(dá)，同時(shí)在AIS中風(fēng)病人的血漿樣本得到證實(shí)。敲低circHectd1表達(dá)后，可明顯減少中風(fēng)小鼠模型的腦梗塞區(qū)域,減少神經(jīng)毒性以及改善星形膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)一步分子機(jī)制研究表明，circHECTD1可以通過(guò)miRNA海綿作用競(jìng)爭(zhēng)性吸附miRNA-142,抑制miRNA-142的活性，導(dǎo)致TIPARP（TCDD誘導(dǎo)型聚[ADP-核糖]聚合酶）表達(dá)的抑制，隨后通過(guò)巨自噬/自噬抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。

研究方案：

1、篩選腦缺血相關(guān)circRNA----( circHECTD1在缺血腦組織中上調(diào))

作者首先在中風(fēng)模型和對(duì)照小鼠的缺血性腦組織（n=3）,進(jìn)行circRNA芯片檢測(cè)，篩選到5個(gè)上調(diào)的circRNA(Figure1 A,B,C)； 并設(shè)計(jì)divergent 和convergent引物在cDNA和gDNA上進(jìn)行PCR鑒定（Figure1 D），定量PCR結(jié)果驗(yàn)證了circ_008488（circHECTD1）的顯著高表達(dá)；為驗(yàn)證該circ參與中風(fēng)，作者在急性缺血性中風(fēng)（AIS）（n=37）和健康人(n=47)血漿中通過(guò)PCR驗(yàn)證circHECTD1的上調(diào)（E）。

二、 circHECTD1 功能驗(yàn)證-----（干擾circHECTD1后腦梗塞降低）

為驗(yàn)證其中風(fēng)功能，作者將攜帶circHECTD1 siRNA的慢病毒顯微注射入小鼠側(cè)腦室(A)，驗(yàn)證siRNA的傳染效果（B）和干擾circHECTD1的效果（C）,慢病毒注射2周后開(kāi)始構(gòu)建tMCAO模型，24小時(shí)后核磁共振檢查腦梗面積，TTC染色檢測(cè)體積，發(fā)現(xiàn)干擾circHECTD1后腦梗死面積顯著降低（D，E）; 神經(jīng)缺陷得分也顯著下降（F）。

三、circHECTD1 作用機(jī)制
1.體內(nèi)干擾circHECTD1后抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活性

為研究其機(jī)制，研究者在同樣的實(shí)驗(yàn)組（中風(fēng)模型和對(duì)照小鼠的缺血性腦組織，n=3）,進(jìn)行mRNA芯片檢檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)515個(gè)上調(diào)和87個(gè)下調(diào)(1.5倍)mRNA（A，B，C）； 為驗(yàn)證芯片結(jié)果，對(duì)GFAP進(jìn)行PCR和wb檢測(cè)，驗(yàn)證其高表達(dá)（D,E）; 并驗(yàn)證GFAP與circHECTD1共定位（F）；為驗(yàn)證circHECTD1角色，將circHectd1-siRNA-GFP注射模型小鼠，免疫熒光顯示GFAP與circHectd1-siRNA共定位（G）；腦切片免疫熒光標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，顯示活性星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)在皮質(zhì)半影區(qū)（H）; 活性星形膠質(zhì)細(xì)胞在circCon siRNA組中升高，但在circHectd1-siRNA組中得到改善（I,J）, WB進(jìn)一步驗(yàn)證GFAP在circHectd1-siRNA組中顯著降低。

2.體外干擾circHECTD1后抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活性

作者進(jìn)一步在小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞（AS）和人膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172中檢測(cè)circHECTD1對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響。

3. circHECTD1介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的機(jī)制研究---- circHECTD1 結(jié)合MIR142

首先FISH對(duì)circHECTD1進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)主要位于細(xì)胞質(zhì)，因此作者研究其是否作為ceRNA結(jié)合miRNA，RNAhybrid軟件顯示其具有MIR142結(jié)合位點(diǎn)（A），F(xiàn)ISH顯示兩者共定位（B），PCR顯示MIR142在AIS病人中下調(diào) C, OGD-R處理細(xì)胞后MIR142 下調(diào)（E,F）；pull down顯示MIR142模擬五可拉下circHECTD1 (G)，circHECTD1探針可拉下MIR142 (H).

4. circHECTD1-MIR142的靶基因驗(yàn)證

作者進(jìn)一步研究MIR142的靶基因。通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)MIR142可靶向TIPARP（A），熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證其相互作用（B）； mRNA芯片（C,D） 和PCR、wb（E,F）顯示靶基因在模型小鼠中上調(diào)。免疫熒光顯示TIPARP與GFAP共定位（G）；AS和A172細(xì)胞中MIR142可下調(diào)TIPARP表達(dá)（H,I），體內(nèi)干擾circHECTD1后TIPARP表達(dá)下調(diào)（J）.

5. 進(jìn)一步驗(yàn)證circHECTD1-MIR142-TIPARP促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性

作者通過(guò)拯救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這一ceRNA軸中的分子對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GEAP的表達(dá)的調(diào)控

6. circHECTD1對(duì)自噬的調(diào)控

越來(lái)越多的證據(jù)表明自噬參與了星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，并參與了腦卒中的發(fā)病機(jī)制，因此作者研究circHECTD1是否通過(guò)自噬激活星形膠質(zhì)細(xì)胞。首先證明星形膠質(zhì)細(xì)胞激活與自噬相關(guān)：檢測(cè)OGD-R刺激上調(diào)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)（A,B）和自噬流信號(hào)（C）。然后證明circHECTD1影響自噬：免疫熒光顯示circHECTD1干擾后抑制OGD-R誘導(dǎo)MAP1LC3B的表達(dá)（D）,pcr和wb進(jìn)一步驗(yàn)證（E,F），體內(nèi)證明circHECTD1干擾后MAP1LC3B表達(dá)降低（G）.

7. circHECTD1-MIR142 axis通過(guò)TIPARP調(diào)控自噬進(jìn)而激活星形膠質(zhì)細(xì)胞

circHECTD1-MIR142-TIPARP對(duì)自噬的影響：干擾circHECTD1能夠改善anti-MIR142誘導(dǎo)的自噬（A），過(guò)表達(dá)circHECTD1能夠改善MIR142誘導(dǎo)的MAP1LC3B-II下調(diào)（B）, Tiparp siRNA顯著抑制OGD-R引起的自噬（C）。進(jìn)一步檢測(cè)自噬對(duì)星星價(jià)值細(xì)胞的影響：自噬抑制劑3-MA降低OGD-R引起的膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP和自噬標(biāo)志物MAP1LC3B-II的表達(dá)（D，E），自噬激動(dòng)劑rapamycin起想反作用（F,G）