miR-103靶向lncWDR59促進(jìn)內(nèi)皮適應(yīng)不良

血流在動脈分叉和彎曲處會受到自然干擾。內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）不能適應(yīng)受干擾的流動，轉(zhuǎn)錄直接導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞向適應(yīng)不良表型轉(zhuǎn)變，其特征是受損的內(nèi)皮細(xì)胞慢性再生。microRNA（miRNAs）可以通過靶向編碼蛋白RNA調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的適應(yīng)不良。然而，長鏈非編碼RNAs（LncRNAs），是已知的表觀控制因子，也可以是miRNA靶標(biāo)，但是miRNAs和LncRNAs對內(nèi)皮細(xì)胞適應(yīng)不良的作用尚不清楚。7月6號德國慕尼黑大學(xué)的研究人員在nature communications（IF=12.353）雜志上發(fā)表了題為“miR-103 promotes endothelial maladaptation by targeting lncWDR59”的文章，這篇文章表明，高脂血癥和oxLDL誘導(dǎo)miR-103上調(diào)，miR-103通過靶向新的LncWDR59抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并促進(jìn)內(nèi)皮DNA損傷。miR1-03通過阻礙LncWDR59與Notch1抑制劑Numb相互作用，從而影響Notch1誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖。此外，miR-103通過影響Notch1相關(guān)的β-連環(huán)蛋白共激活，增加增殖的內(nèi)皮細(xì)胞對oxLDL誘導(dǎo)的有絲分裂畸變的敏感性，其特征是增加微核形成和DNA損傷積累。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明miR-103通過靶向LncWDR59使內(nèi)皮細(xì)胞向適應(yīng)不良表型轉(zhuǎn)變，這可能促進(jìn)動脈粥樣硬化。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

圖1 在EC-Dicer flox小鼠中的LncRNAs上調(diào)，let-7b和miR-103的靶向LncRNA。

（a）來自EC-Dicer flox小鼠與喂食12周HFD的EC-Dicer WT小鼠的主動脈中差異表達(dá)的lncRNA基因的全基因組微陣列分析的餅圖。（b）97個(gè)顯著上調(diào)的lncRNA。（c）2個(gè)新lncRNA的完整轉(zhuǎn)錄物序列。（d）let-7b和miR-103靶向的LncRNA。（e）qPCR驗(yàn)證MAoECs中一些lncRNAs在EC-Dicer flox小鼠體內(nèi)上調(diào)。（f）qPCR驗(yàn)證let-7b和miR-103抑制物存在的情況下lncRNAs的表達(dá)。（g）免疫沉淀（GW182-IP）后qPCR測量let-7b或miR-103類似物轉(zhuǎn)染MAoEC后lncRNA轉(zhuǎn)錄物富集情況。

圖2 篩選miR-103靶標(biāo)lncRNAs并鑒定miR-103靶向lncWDR59。

miR-103的靶標(biāo)lncRNAs在不同細(xì)胞或條件的qPCR表達(dá)：（a） MAoECs和BMDM中的表達(dá)，（b）MAoECs在高或低切應(yīng)力下的表達(dá)，（c）MAoECs中oxLDL的處理24個(gè)小時(shí)，（d）好發(fā)部位ARCH和非好發(fā)部位Thoracoabd，（e）正常飲食（ND）或高脂飲食（HFD）12周，（f）EC和斑塊部位。（g）在12周HFD喂養(yǎng)的EC-Dicer WT和EC-Dicer flox小鼠上進(jìn)行miR-103和lncWDR59的原位雜交。（h）TSB特異性抑制miR-103與lncWDR59轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合。

圖3 miR-103靶向lncWDR59通過Wnt和Notch1信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)EC增殖。

用miR-103抑制劑（miR-103inh），lncWDR59 Gapmers（GlncWDR59）或TSB（a）轉(zhuǎn)染MAoEC 24小時(shí)以檢查Ccl2和Cxcl1相對表達(dá)或（b）用抗Ki67抗體染色通過qPCR分析它們的增殖和cdkn1a表達(dá)。（c）將MAoEC與EdU和TSB或?qū)φ誏NA一起孵育。使EC經(jīng)受LSSHSS并染色。（d）用siCtnnb1或sDAPT處理MAoEC 24小時(shí)，用抗Ki67抗體染色以分析它們的增殖。（e,f）miR-103抑制物，TSB或GlncWDR59檢測NICD和β-連環(huán)蛋白的表達(dá)。（g - j）MAOECs用DAPT或siCtnnb1單獨(dú)或與TSB聯(lián)合處理24小時(shí)進(jìn)行分析（g）通過Ki67染色的EC增殖。（h）用DAPT或DMSO刺激Ki67 + TSB + siCtnnb轉(zhuǎn)染的MAoEC的分析。分析β-連環(huán)蛋白（i）或NICD（j）核定位。

圖4 LncWDR59與Notch1抑制劑Numb的相互作用。

（a）用miR-103或?qū)φ?LNA抑制劑處理24小時(shí)的MAoEC中的核和細(xì)胞質(zhì)lncWDR59水平。b通過qPCR分析在NICD免疫沉淀（IP）之后的MAoEC中的LncWDR59表達(dá)。（c）表示lncWDR59和Numb之間相互作用傾向分析的熱圖。（d）miR-103抑制物處理MAoECs24個(gè)小時(shí)通過qPCR分析LncWDR59表達(dá)。（e）NICD與Numb定量的結(jié)合來評估Numb-IP效率。

圖5 lncWDR59在ECs中對高脂血癥介導(dǎo)的DNA損傷和MN形成的作用。

（a）用25或100μgml -1 的oxLDL 處理24小時(shí)后MAoEC中Ki67或磷酸化γH2AX組蛋白的免疫熒光分析。（b）ND或HFD并染色γH2AX和CD31。（c）與EC-Dicer WT小鼠相比，EC-Dicer flox小鼠γH2AX + vWF +的分析。（d）用TSB處理24小時(shí)的MAoEC用或不用25μgml -1 oxLDL后γH2AX +分析。（e） MAoECs被用于與DAPT或siCtnnb1分析24個(gè)小時(shí)處理的核γH2AX +染色。（f）用ND或HFD喂養(yǎng)12周的Apoe - / -小鼠γH2AX 和MN分析。（g）25或100μgml -1 oxLDL 處理24小時(shí) 后MN形成和γH2AX +的分析。（h）用TSB處理24小時(shí)并用或不用25μgml -1 oxLDL 刺激MN形成和γH2AX +分析 。（i）DAPT或siCtnnb1與25μgml -1 oxLDL組合處理24小時(shí)后MN形成和γH2AX +分析。

圖6 Sox17在β-連環(huán)蛋白激活，MN形成和DNA損傷中的作用。

（a）用TSB處理后MAoEC中的Sox17表達(dá)的 qPCR分析。（b）用DAPT或siCtnnb1處理24小時(shí)后MAoEC中Sox17表達(dá)的qPCR分析。（c,d）分析核（星）和核周（箭頭）β-連環(huán)蛋白，活化的Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）（c）核Ki67染色（d）用Sox17單獨(dú)或與TSB組合處理24小時(shí)的MAoEC。（e,f） γH2AX+和MN的分析。

圖7 MiR-103 / lncWDR59在動脈粥樣硬化期間在體內(nèi)具有保守功能。

（a）EVG染色，（b）Ki67和（c）γH2AX免疫熒光染色。

圖8 人類lncWDR59的保守作用。

（a）人類lncWDR59（hsa-lncWDR59）序列的基因座和完整轉(zhuǎn)錄物。（b），用miR-103類似物富集lncWDR59。（c）用hsa-lncWDR59 gapmer（hGlncWDR59）轉(zhuǎn)染HAoEC48小時(shí)后Ki67免疫染色和MN形成的分析。（d） miR-103和lncWDR59在人斑塊上的原位雜交。缺乏病變的區(qū)域用作對照區(qū)域。（e）hsa-lncWDR59與SOX17表達(dá)和Ki67染色的相關(guān)性。