血清外泌體介導精氨酸酶1作為糖尿病內皮功能障礙的新機制

內皮細胞功能障礙在糖尿病血管疾病中起著至關重要的作用，但其機制尚不完全清楚。外泌體通過在細胞間傳遞分子參與細胞通信。內皮細胞對血清外泌體的反應以及糖尿病相關血管疾病影響還沒有相關報道。7月17日香港中文大學深圳研究所黃聿研究組在Proc Natl Acad Sci USA（IF=9.5）上發(fā)表論文，他們通過對糖尿病Db／Db小鼠血清中的外泌體進行純化和鑒定，觀察到這些性激素進入非完整糖尿病大鼠主動脈內皮細胞，內皮依賴性舒張功能受損。進一步的研究表明，外周體精氨酸酶1最有可能成為糖尿病血管疾病的調節(jié)劑。

技術路線

研究結果
1.dp/dp 小鼠血清中分離的外泌體進入內皮細胞。

圖1.外泌的分離及其被內皮細胞吸收。

A.外泌體電鏡鑒定。B.外泌體粒徑密度分布分析。C.WB鑒定外泌體。D.PKH67和DAPI染色檢測外泌體被內皮細胞吸收的情況。

2.從糖尿病小鼠中分離出的外泌體對非糖尿病小鼠動脈的內皮細胞產(chǎn)生損害。

圖2. 從dp/dp小鼠中分離出的外泌體對dp/m+小鼠動脈的內皮細胞產(chǎn)生損害。

A. dp/dp小鼠血清外泌體高于dp/m+小鼠。B. 糖尿病小鼠血清外泌體的含量高于非糖尿病小鼠。C、D.外泌體抑制乙酰膽堿誘導的主動脈內皮依賴性舒張。E外泌體減弱了腸系膜動脈的內皮依賴性舒張。F. dp/dp和dp/m+來源的外泌體尾部注射入dp/m+小鼠，dp/dp 小鼠來源的外泌體對內皮依賴性舒張產(chǎn)生損害。G. PKH和DAPI染色顯示肝素可以抑制內皮細胞對外泌體的吸收。H.肝素改善dp/dp小鼠外泌體誘發(fā)的內皮細胞功能障礙。

3.dp/dp小鼠外泌體中的外泌體蛋白在誘發(fā)內皮細胞功能障礙中起到了重要的作用。

圖3. 外泌體蛋白在誘發(fā)內皮細胞功能障礙中起到了重要的作用。

A. 去除dp/dp小鼠的外泌體中蛋白質和RNA。B.電鏡檢測外泌體。C. WB檢測外泌體。D.PCR分析不同方法處理后外泌體中各種miRNA的水平。E.外泌體中的蛋白質而不是RNA造成的血管內皮功能障礙。

4.dp/dp小鼠外泌體介導的精氨酸1（ARG1）水平的升高可以介導內皮細胞功能紊亂，且外泌體中的精氨酸1可以減少內皮細胞中NO的生成。

圖4.糖尿病小鼠外泌體介導的ARG 1增加，并且參與了dp/dp小鼠外泌體對內皮細胞功能的損害。

A.WB檢測外泌體相關蛋白。B.WB檢測外泌體中Arg1和CD63蛋白的表達。C.外泌體中Arg1的活性要高于血清中的Arg1活性。D. dp/dp小鼠外泌體加入Arg1抑制劑于dp/m+小鼠的主動脈中。E.WB檢測Arg1蛋白。F. dp/dp小鼠外泌體處理后精氨酸和鳥氨酸水平的檢測。G. dp/dp小鼠外泌體處理后可以減少NO的產(chǎn)生。

5.在dp/dp小鼠內皮細胞中，外泌體是Arg1的主要來源。

圖5. dp/dp小鼠和dp/dm+小鼠Arg1 蛋白和基因的表達。

A.熒光染色檢測dp/dp小鼠和dp/dm+小鼠Arg1 蛋白表達。B. qPCR分析顯示dB/m +和dB/db小鼠主動脈內皮細胞中Arg1和Arg2的mRNA表達水平。C. 在原位雜交中發(fā)現(xiàn)的db/db或db/m+肝、脾和主動脈的內源性Arg1表達。D.加入外泌體抑制劑后檢測Arg1的表達。E. 用Arg1-shRNA體外敲除Arg1并不能挽救db／db小鼠主動脈內皮功能。F. 敲除Arg1-shRNA對db/db外泌體誘導的內皮功能障礙的影響。

6.ARG1敲除恢復了db/db小鼠的內皮細胞功能。

圖6.敲除Arg1提高db/db小鼠的EDRS。

A. 免疫熒光圖像顯示，在db/db小鼠主動脈內皮細胞中Arg1蛋白表達。B. 敲除Arg1可以恢復血管依賴性舒張。C、D：敲除Arg1增加了db/db小鼠主動脈的亞硝酸鹽水平。E.WB檢測Arg1蛋白表達。F. 敲除Arg1后的db/db小鼠外泌體注射入dB/m +小鼠，其EDRS功能沒有損害。

7.體內ARG1過表達導致db/m+小鼠內皮功能障礙。

圖7.Arg1過度表達損害db/m+小鼠內皮功能。

A. 免疫熒光圖像顯示在db/M+小鼠主動脈內皮細胞中ARG1蛋白表達。B、C、D Arg1過度表達減弱EDRS，這種效應可以被L-精氨酸逆轉。E.WB檢測Arg1和CD63蛋白水平。F. 從AG1過度表達的db/m+小鼠中分離出的外泌體蛋白在4~8小時孵育后，db/m+小鼠主動脈中觸發(fā)內皮功能障礙。G. 外泌體在糖尿病相關內皮功能障礙中的作用。