circEPSTI1作為三陰性乳腺癌進(jìn)展的預(yù)后標(biāo)志物和介質(zhì)

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類非編碼RNA，其在調(diào)節(jié)基因表達(dá)和許多病理反應(yīng)中起重要作用。然而，三陰性乳腺癌（TNBC）中circRNA的表達(dá)譜和功能尚未可知。近日，發(fā)表在《Theranostics》（IF=8.537）上的一篇名為《circEPSTI1 as a Prognostic Marker and Mediator of Triple-Negative Breast Cancer Progression》的文章研究了人類circRNA在TNBC組織中的表達(dá)譜，并鑒定出circEPSTI1（hsa_circRNA_000479）是顯著上調(diào)的circRNA。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行circRNA微陣列分析以篩選TNBC的circRNA表達(dá)譜，并進(jìn)一步研究了circEPSTI1，通過敲低三種TNBC細(xì)胞系中的circEPSTI1觀察了circEPSTI1對(duì)TNBC增殖，克隆形成和凋亡的影響。基于MRE分析和熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定，發(fā)現(xiàn)circEPSTI1作為miRNA海綿和miRNA的共靶基因與miRNA結(jié)合，并在小鼠中進(jìn)行異種移植實(shí)驗(yàn)以證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)。同時(shí)，通過ISH評(píng)估了240名TNBC患者的circEPSTI1水平。結(jié)果顯示，敲低circEPSTI1抑制TNBC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，circEPSTI1作為miRNA海綿與miR-4753和miR-6809結(jié)合，以調(diào)節(jié)BCL11A表達(dá)并影響TNBC的增殖和凋亡。高水平的circEPSTI1與TNBC患者的存活率降低相關(guān)。circEPSTI1-miR-4753/6809-BCL11A通過競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNAs（ceRNA）機(jī)制影響三陰性乳腺癌的增殖和凋亡。此外，將circEPSTI1鑒定為TNBC患者存活的獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志物。

技術(shù)路線

結(jié)果

圖1. TNBC中的差異環(huán)狀RNA的鑒定。

（A）三對(duì)人TNBC癌組織和鄰近正常組織中差異表達(dá)的circRNA的聚類熱圖。上調(diào)（紅色）或下調(diào)（綠色）的circRNA分別呈現(xiàn)。（B）TNBC癌組織與鄰近正常組織中circRNA表達(dá)比較的火山圖。紅點(diǎn)代表circRNA上調(diào)或下調(diào)了1.5倍，P值<0.05。（C）散點(diǎn)圖用于評(píng)估TNBC癌組織和鄰近正常組織之間circRNA表達(dá)的變化。綠線是倍數(shù)變化線。（D）差異表達(dá)的circRNA在染色體上的分布規(guī)則。（E）TNBC中差異表達(dá)circRNA的基因組起源。（F）EPSTI1基因和circEPSTI1的基因組位點(diǎn)。通過qRT-PCR檢測(cè)circEPSTI1的表達(dá)，并通過Sanger測(cè)序驗(yàn)證。（G）通過qRT-PCR測(cè)定乳腺正常細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系中circEPSTI1的表達(dá)水平。倍數(shù)變化基于β-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。（H）37對(duì)TNBC樣本和相應(yīng)的正常鄰近組織中circEPSTI1的表達(dá)水平。（I）用RNase R處理MDA-MB-231細(xì)胞后，circEPSTI1和EPSTI1 mRNA的qRT-PCR分析。（J）放線菌素D處理后MDA-MB-231細(xì)胞中circEPSTI1和EPSTI1 mRNA的qRT-PCR分析。

圖2. circEPSTI1的沉默抑制TNBC生長(zhǎng)和增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

（A）circEPSTI1的siRNA特異性反向剪接點(diǎn)的位點(diǎn)示意圖。（B）用兩種siRNA處理后circEPSTI1和EPSTI1 mRNA表達(dá)的qRT-PCR分析。（C-E）用對(duì)照或circEPSTI1 siRNA轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231，BT549和MDA-MB-468細(xì)胞的CCK-8測(cè)定。（F-H）用對(duì)照或circEPSTI1 siRNA轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231，BT549和MDA-MB-468細(xì)胞集落形成的測(cè)定。（I）用對(duì)照或circEPSTI1 siRNA轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231，BT549和MDA-MB-468細(xì)胞中使用EdU評(píng)估DNA合成。（J）膜聯(lián)蛋白V-FITC/碘化丙啶染色和FACS定量經(jīng)特定處理后的MDA-MB-231，BT549和MDA-MB-468細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)。** P <0.01。

圖3. circEPSTI1充當(dāng)miR-4753和miR-6809的miRNAs海綿。

（A）circEPSTI1中miR-4753和miR-6809預(yù)測(cè)位點(diǎn)的示意圖。（B-C）用加擾對(duì)照，miR-4753類似物，miR-6809類似物，miR-4753 + miR-6809類似物，對(duì)照-LNA，miR-4753-LNA，miR-6809-LNA或miR-4753 + miR-6809-LNA和含有circEPSTI1野生型或miR-4753和miR-6809結(jié)合位點(diǎn)突變結(jié)構(gòu)的熒光素酶報(bào)告基因（circEPSTI1-mut）共轉(zhuǎn)染的HEK 293T細(xì)胞的熒光素酶測(cè)定。* P <0.05；** P <0.01。（D）用加擾對(duì)照，miR-4753類似物，miR-6809類似物或miR-4753 + miR-6809類似物轉(zhuǎn)染后circEPSTI1的qRT-PCR分析。（E）用NC+對(duì)照-LNA，si-crEPSTI1-1+對(duì)照-LNA，NC + miR-4753 + miR-6809-LNA或si-crEPSTI1-1 + miR-4753 + miR-6809-LNA轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231的集落形成的測(cè)定。（F）用NC+對(duì)照-LNA，si-crEPSTI1-1+對(duì)照-LNA，NC + miR-4753 + miR-6809-LNA或si-crEPSTI1-1 + miR-4753+ miR-6809-LNA轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞的5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）測(cè)定。

圖4. BCL11A是miR-4753和miR-6809的直接靶基因，并且被circEPSTI1敲低所抑制。

（A）基于三種算法（TargetScan（TS），MIRDB和TARGETMINER TM）表示miR-4753和miR-6809的共靶基因重疊得Venn圖。Venn圖工具可從http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/獲得。（B）miR-4753和miR-6809在BCL11A mRNA的3'UTR上預(yù)測(cè)位點(diǎn)的示意圖。（C-D）用加擾對(duì)照，miR-4753類似物，miR-6809類似物，miR-4753 + miR-6809類似物，對(duì)照-LNA，miR-4753-LNA，miR-6809-LNA或miR-4753 + miR-6809-LNA和含有BCL11A-3'UTR野生型或miR-475和miR-6809結(jié)合位點(diǎn)突變（BCL11A-3'UTR-mut）的熒光素酶報(bào)告基因結(jié)構(gòu)共轉(zhuǎn)染的HEK 293T細(xì)胞的熒光素酶測(cè)定。（E）用加擾對(duì)照，miR-4753類似物，miR-6809類似物，miR-4753 + miR-6809類似物，對(duì)照-LNA，miR-4753-LNA，miR-6809-LNA或miR-4753 + miR-6809-LNA轉(zhuǎn)染后BCL11AmRNA的qRT-PCR分析。（F-G）通過Western雜交測(cè)定miR-4753 / miR-6809類似物或miR-4753 / miR-6809抑制劑對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中BCL11A蛋白表達(dá)的影響。（H）敲低circEPSTI1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中BCL11A蛋白表達(dá)的影響。

圖5. circEPSTI1-miR-4753/6809-BCL11A影響TNBC體內(nèi)生長(zhǎng)和增殖。

將（A）MDA-MB-231，（B）BT549和（C）MDA-MB-468細(xì)胞皮下注射到裸鼠中并進(jìn)行不同處理（即加擾或si-cEPSTI1-1）。繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線。** P <0.01。（D）小鼠異種移植模型中的腫瘤。（E）異種移植腫瘤的重量。（F）通過免疫組化分析異種移植腫瘤，并呈現(xiàn)BCL11A，caspase-2和ki-67表達(dá)的典型圖像。比例尺=50μm。

圖6. circEPSTI1與BCL11A表達(dá)正相關(guān)，并充當(dāng)TNBC的預(yù)后因子。

（A）TNBC組織微陣列數(shù)據(jù)分析（n = 240），證明了circEPSTI1與BCL11A的線性回歸和顯著Pearson相關(guān)性。（B）circEPSTI1的典型H＆E和原位雜交圖像和兩個(gè)TNBC病例中的BCL11A表達(dá)的免疫組化圖像（200× 比例尺=100μm；400× 比例尺=50μm;）。（C-D）高水平的circEPSTI1與DFS和OS減少相關(guān)（circEPSTI1 low n = 157；circEPSTI1 high n = 83）。（E-F）給出了circEPSTI1和BCL11A表達(dá)的四種可能組合的DFS和OS曲線。高水平的circEPSTI1和BCL11A與存活率降低相關(guān)（circEPSTI1 low/BCL11A low n = 119；circEPSTI1 high/BCL11A low n = 50；circEPSTI1 low/BCL11A high n = 39；circEPSTI1 high/BCL11A high n = 32）。