Prodrug suicide gene therapy for cancer targeted intracellular by mesenchymal stem cell exosomes

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）及其外泌體由于其靶向腫瘤中的天然行為被認(rèn)為是一種有前景的治療方法。近日，來(lái)自斯洛伐克科學(xué)院的Altaner和他的團(tuán)隊(duì)在INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER（IF=7.36）在線發(fā)表了題目“Prodrug suicide gene therapy for cancer targeted intracellular by mesenchymal stemcell exosomes”的文章，他們?cè)O(shè)計(jì)自殺基因yCD::UPRT在各種人體組織制備的MSCs表達(dá)。該自殺基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的CM包含外泌體，載著自殺基因的mRNA。該外泌體很容易被腫瘤細(xì)胞內(nèi)化，在前體藥物5-氟胞嘧啶（5-FC）的存在下，攜帶自殺基因的外泌體可以使腫瘤細(xì)胞以劑量依賴性的方式死亡。根據(jù)他們的檢測(cè)，由MSC和自殺基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC產(chǎn)生的外來(lái)體中微小RNA的存在沒(méi)有顯著差異，與治療效果無(wú)關(guān)。 攜帶自殺基因MSC外泌體代表了一類新的腫瘤細(xì)胞靶向藥物在細(xì)胞內(nèi)起作用并具有治愈潛力。

技術(shù)路線

主要結(jié)果

1 從各種人組織獲得的MSC可以用CD :: UPRT自殺基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。

圖1 貫穿整個(gè)工作的實(shí)驗(yàn)步驟。

（A，B）從各種組織中分離和擴(kuò)增MSC;（C）攜帶yCD :: UPRT或tk / HSV自殺基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染MSCs; （D）選擇自殺基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞群;（E）收獲有條件的媒介;（F）從CM中分離外泌體;（G）檢測(cè)外泌體貨物中自殺基因的mRNA;（H）用CM和yCD :: UPRT-外泌體抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng);（I）CM，外泌體和LMWC對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響; （J）MSCs和yCD :: UPRT-MSC外泌體中miRNA的表達(dá)譜。

2 與相應(yīng)MSCs相比，不同來(lái)源yCD::UPRT-MSCs對(duì)條件培養(yǎng)基腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)更加顯著。

圖2 yCD :: UPRT基因在同源培養(yǎng)的yCD :: UPRT- MSCs中的表達(dá)

（A）PCR擴(kuò)增來(lái)自yCD :: UPRT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC的分離的細(xì)胞DNA。 凝膠分辨率證實(shí)了特定序列的存在（B）通過(guò)Nanosight檢測(cè)從yCD :: UPRT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC釋放的外泌體;（C）來(lái)自yCD :: UPRT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC的分離的經(jīng)DNase處理的總RNA被逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳顯現(xiàn)特定轉(zhuǎn)錄物的存在。（D）qRT-PCR估計(jì)各種yCD :: UPRT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC的細(xì)胞DNA中整合的DNA yCD :: UPRT基因的相對(duì)拷貝數(shù)。（E）qRT-PCR估計(jì)來(lái)自yCD :: UPRT轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC的外來(lái)體中mRNA的相對(duì)表達(dá);（F）外來(lái)體貨物中yCD :: UPRT基因的mRNA與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性的比較。

3 來(lái)自yCD::UPRT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)不同組織來(lái)源的MSCs的CM, LMWC, 外泌體的不同腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制療效不同。

圖3 不同MSCs外泌體表達(dá)yCD::UPRT基因的對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性的評(píng)估。

（A）刺激了在不存在前藥b5-FC的情況下用來(lái)自yCD :: UPRT-AT-MSC的CM處理的PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)，但未檢測(cè)到HeLa1a細(xì)胞的生長(zhǎng)刺激。（B）在5-FC存在下，用來(lái)自yCD :: UPRT-AT-MSC的CM處理的人前列腺腫瘤細(xì)胞PC3的生長(zhǎng)被劑量依賴性地抑制; （C）人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的生長(zhǎng)在5-FC存在下以劑量依賴性地被抑制，但是在沒(méi)有5-FC的情況下沒(méi)有影響他們的成長(zhǎng); （D）大鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞C6被來(lái)自yCD :: UPRT-MB-MSC的CM有效殺死，并被yCD :: UPRT-BM-MSC部分殺死。（E）在5-FC存在下，yCD :: UPRT-MSC的CM中外泌體的腫瘤細(xì)胞死亡功效的比較(與具有相同蛋白質(zhì)含量值（50μg）的CM樣品)。

圖4 yCD中CM的篩析::UPRT-AT-MSCs和外泌體的腫瘤細(xì)胞特異性。

(A) CM與yCD::UPRT-AT-MSCs分離;(B)不同yCD::UPRT轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSCs中CM的特異性。

4 MSCs及相應(yīng)的yCD::不同組織來(lái)源的UPRT-MSCs的microrna的表達(dá)沒(méi)有顯著不同。

圖5 未轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC外泌體和yCD:: uprt -基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中外泌體差異表達(dá)的mirna表達(dá)譜。

(A)根據(jù)組織類型和是否存在yCD::UPRT基因，對(duì)2549個(gè)微陣列中檢測(cè)到的microRNAs(綠柱)數(shù)量進(jìn)行比較。(B)基于子集(276 miRNA，至少在75%的樣品中表達(dá);)液的檢測(cè)小分子核糖核酸釋放不同的組織起源MSC和相應(yīng)的yCD::UPRT gene-transduced MSC之間的表達(dá)差異(BH調(diào)整p值> 0.05)。