一種新的lncRNA，ZFPM2-AS1通過(guò)穩(wěn)定MIF來(lái)抑制p53途徑并促進(jìn)胃癌發(fā)生

長(zhǎng)鏈非編碼RNAs（lncRNs）與多種癌癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。2018年7月 9號(hào)Oncogene雜志上發(fā)表了一篇題為“ZFPM2-AS1, a novel lncRNA, attenuates the p53 pathway and promotes gastric carcinogenesis by stabilizing MIF”的文章，論文報(bào)道了一種新的lncRNA，ZFPM2反義RNA1（ZFPM2-AS1）在胃癌發(fā)生中的關(guān)鍵作用。應(yīng)用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)對(duì)胃癌組織中ZFPM2-AS1進(jìn)行了分析，并用qRT-PCR在73對(duì)胃癌組織和正常胃組織標(biāo)本進(jìn)行了驗(yàn)證。通過(guò)改變ZFPM2-AS1在體外和體內(nèi)的表達(dá)，評(píng)價(jià)ZFPM2-AS1表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。采用細(xì)胞和分子生物學(xué)方法進(jìn)行機(jī)理研究。ZFPM2-AS1在胃腫瘤組織中的表達(dá)高于正常胃組織。胃癌組織中ZFPM2-AS1表達(dá)的增加與腫瘤大小、腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度、TNM分期有關(guān)。ZFPM2-AS1高表達(dá)可顯著降低胃癌患者的總生存期和無(wú)病生存期。功能實(shí)驗(yàn)表明，ZFPM2-AS1表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，這種作用與p53的核轉(zhuǎn)位減弱有關(guān)。機(jī)械實(shí)驗(yàn)表明，腫瘤激活的ZFPM2-AS1可以結(jié)合并保護(hù)一種有效的p53失穩(wěn)劑-巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）的降解。敲除MIF可降低ZFPM2-AS1對(duì)胃癌細(xì)胞p53表達(dá)的影響。

這些研究結(jié)果表明ZFPM2-AS1調(diào)節(jié)胃癌進(jìn)展，并揭示了一種新的ZFPM2-AS1/MIV/p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)軸，闡明了某些惡性胃癌細(xì)胞致瘤性的分子機(jī)制。

技術(shù)路線

結(jié)果：

圖1. ZFPM2-AS1表達(dá)上調(diào)預(yù)示胃癌預(yù)后不良。

（a）ZFPM2-AS1的5'，3'和全長(zhǎng)RACE。（b）ZFPM2-AS1位置示意圖。ZFPM2-AS1的部分序列在反義鏈中與ZFPM2蛋白編碼基因的內(nèi)含子重疊。（c）胃癌和鄰近非腫瘤胃組織標(biāo)本中ZFPM2-AS1的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果表示為log2（2-△△Ct）。（d）使用qRT-PCR分析胃癌和鄰近非腫瘤胃組織標(biāo)本（n = 73）中的ZFPM2-AS1表達(dá)。將ZFPM2-AS1表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為U6的表達(dá)水平。（e）ZFPM2-AS1在正常胃細(xì)胞（GES-1）和胃癌細(xì)胞系（AGS，BGC-823，MGC-803，MKN-28，MKN-45和SGC-7901）中的表達(dá)水平。（f）根據(jù)基于qRT-PCR的ZFPM2-AS1表達(dá)水平預(yù)測(cè)胃癌的受試者 - 操作特征曲線。（g，h）Kaplan-Meier分析胃癌患者的總生存期（OS）（g）和無(wú)病生存期（DFS）（h）。

圖2. ZFPM2-AS1在體外促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖并抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。

（a） 在體外用生長(zhǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）評(píng)估胃癌細(xì)胞在體外生長(zhǎng)。OD光密度。* P <0.05。（b）用ZFPM2-AS1特異性shRNA（sh＃1和sh＃2）或非靶向?qū)φ誷hRNA（shNC）轉(zhuǎn)染AGS和MKN-45細(xì)胞的克隆形成實(shí)驗(yàn)。 （c）進(jìn)行EdU摻入測(cè)定以確定ZFPM2-AS1抑制對(duì)胃癌細(xì)胞增殖期間DNA合成的影響。敲除ZFPM2-AS1降低了總胃癌細(xì)胞中EdU陽(yáng)性（S期）細(xì)胞的比例。（d）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSZFPM2-AS1處理48小時(shí)后對(duì)AGS和MKN-45細(xì)胞周期阻滯的影響。* P <0.05（e）用流式細(xì)胞術(shù)分析SZFPM2-AS1或SHNC治療后AGS和MKN-45細(xì)胞的凋亡率。* P <0.05

圖3. ZFPM2-AS1在體內(nèi)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

將ZFPM2-AS1表達(dá)質(zhì)?；騭hRNA處理后的AGS細(xì)胞經(jīng)皮下注射到裸鼠的左大腿（每只小鼠1×10 6個(gè)細(xì)胞，每組5只小鼠）。在所示小鼠組中顯示了腫瘤生長(zhǎng)曲線（a1，a2; * P <0.05），腫瘤重量（b1，b2）和腫瘤（c1，c2）。（d）Ki67腫瘤組織免疫組化染色的代表性圖像

圖4. ZFPM2-AS1負(fù)調(diào)控p53蛋白的表達(dá)并抑制p53下游分子的表達(dá)。

（a）Western印跡分析表明，ZFPM2-AS1表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)改變了胃癌細(xì)胞系中p53及其下游靶標(biāo)cyclin D1，cyclin E1，p21和PUMA的表達(dá)。（b）ZFPM2-AS1敲除改變了p53下游基因的mRNA表達(dá)，但沒(méi)有改變胃癌細(xì)胞系中p53 mRNA的表達(dá)水平。 * P <0.05。（c）AGS和MKN-45細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。 * P <0.05。 （d）shZFPM2-AS1轉(zhuǎn)染有或沒(méi)有siTp53存在的胃癌細(xì)胞的凋亡分析。 *與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）; 與shZFPM2-AS1組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）

圖5. ZFPM2-AS1與MIF結(jié)合并增加MIF表達(dá)。

（a）帶有銀染色的SDS-PAGE分析顯示來(lái)自AGS細(xì)胞的免疫沉淀蛋白被ZFPM2-AS1或其反義RNA拉下。箭頭表示隨后可能切除用于質(zhì)譜分析的ZFPM2-AS1結(jié)合蛋白。 （b）生物素化的ZFPM2-AS1或反義RNA與AGS和MKN-45細(xì)胞的全細(xì)胞蛋白裂解物在另一種RNA pull-down測(cè)定中一起孵育。使用特異性MIF抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)MIF蛋白。（c）RIP實(shí)驗(yàn)確定了MIF和ZFPM2-AS1的相互作用。（d）用不同的ZFPM2-AS1片段拉下AGS細(xì)胞的免疫印跡。 （e）在胃癌標(biāo)本中具有高或低ZFPM2-AS1表達(dá)的MIF蛋白表達(dá)的代表性免疫組織化學(xué)圖像（n = 26）。（f）使用Spearman相關(guān)系數(shù)分析（n = 26）評(píng)估ZFPM2-AS1和MIF蛋白表達(dá)之間的直接相關(guān)性。分別檢測(cè)ZFPM2-AS1的表達(dá)和每種胃癌標(biāo)本中MIF蛋白的免疫組織化學(xué)評(píng)分。 W弱，M中等，S強(qiáng)。 （g）通過(guò)RT-qPCR分析ZFPM2-AS1在AGS和MKN-45細(xì)胞裂解物中的細(xì)胞內(nèi)分布。 GAPDH和U6用作內(nèi)部對(duì)照。 （h）在AGS和MKN-45細(xì)胞中ZFPM2-AS1表達(dá)降低或增加后，MIF表達(dá)的Western印跡。（i）qRT-PCR結(jié)果證明ZFPM2-AS1的過(guò)表達(dá)和敲除不影響胃癌細(xì)胞中的MIF mRNA表達(dá)水平。（j）用40μg/ mL CHX處理指定時(shí)間的AGS和MKN-45細(xì)胞中MIF的Western印跡。 （k）Western印跡顯示蛋白酶體抑制劑MG132在有或沒(méi)有shZFPM2-AS1處理48小時(shí)的條件下對(duì)胃癌細(xì)胞中MIF表達(dá)的影響

圖6. ZFPM2-AS1 / MIF軸通過(guò)減弱p53信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。

（a）使用抗-MLF抗體或用抗-p53抗體進(jìn)行對(duì)照IgG對(duì)AGS和MKN-45細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行共免疫沉淀（IP）。使用抗p53和-IgG抗體進(jìn)行相互的共-IP，然后用抗MIF抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。（b）在MIF表達(dá)降低或增加后，AGS和MKN-45細(xì)胞中p53表達(dá)的Western印跡分析。（c，d）qRT-PCR（c）和蛋白質(zhì)印跡（d）分析結(jié)果證明ZFPM2-AS1以MIF依賴(lài)性方式調(diào)節(jié)p53途徑。檢測(cè)了所示組中p53靶向細(xì)胞周期蛋白D1，細(xì)胞周期蛋白E1，p21和PUMA的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。 GAPDH用作加載對(duì)照。 siMIF MIF特異性siRNA。 * P <0.05用于“vector + siNC”和“ZFPM2-AS1 + siNC”之間的比較; #P <0.05用于“ZFPM2-AS1 + siNC”和“ZFPM2-AS1 + siMIF”之間的比較。 （e）用ZFPM2-AS1過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染AGS和MKN-45細(xì)胞的免疫熒光染色，體外培養(yǎng)48小時(shí)，p53（綠色），MIF（紅色）和細(xì)胞核（4'，6-二咪啶-2-苯基吲哚）藍(lán)色）。將ZFPM2-AS1用50nM siMIF或?qū)φ誷iRNA（siNC）共轉(zhuǎn)染到AGS和MKN-45細(xì)胞中48小時(shí)。 Western印跡顯示ZFPM2-AS1通過(guò)激活MIF表達(dá)抑制p53的核轉(zhuǎn)位