核lncRNA Charme的缺乏導致小鼠肌源性缺陷和心臟重塑

欄目：最新研究動態(tài) 發(fā)布時間：2018-09-25
肌生成是一個高度調控的過程，它涉及到祖細胞轉化為多核肌細胞。除了蛋白和miRNAs之外......

肌生成是一個高度調控的過程，它涉及到祖細胞轉化為多核肌細胞。除了蛋白和miRNAs之外，lncRNA已經顯示能夠參與肌生成的調控。在2015年，Irene Bozzoni教授帶領他的團隊在肌的不同分化期做了RNA-seq分析，并發(fā)現了新的lnRNA ，Charme，這篇文章發(fā)表在了Molecular Cell Biology（IF=5.592）雜志。鑒于此，Irene Bozzoni教授帶領他的團隊進一步探究了Charme的特點與對肌生成的影響，并于2018年9月3日發(fā)表在EMBO（IF=10.557）雜志上。這篇文章，鑒定了Charme是一個染色體相關的lncRNA，它能夠在體內體外促進肌源編程。在肌細胞中，Charme敲除后能夠啟動特異性染色體域的解體，在這其中，含有肌源性的基因會下調。特別要提的是， Charme能調節(jié)一些人心肌疾病相關的敏感基因。同時，小鼠Charme敲除后會導致心臟重塑表型的改變，如心臟的大小、結構、形狀等。此外，人同源性Charme能夠調節(jié)相同靶基因簇，它的存在對Charme來說是一個重要且保守的作用。總之，這些數據描述了一個例子，新的染色體相關的lncRNA能夠調節(jié)心肌重塑。


 

技術路線                                   

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結果
1. Charme是一個與染色體相關的lncRNA。

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圖1

A. Charme的基因結構。LNA GAPDH引物的位置： GAP-2, GAP-2/3。原位探針：綠色為內含子，紅色為外顯子。B. sqRT-PCR檢測來自2天的去分化肌小管的細胞質、細胞核、核質或染色體片段中的pCharme和mCharme的表達。片段的質量用GAPDH和pre-GAPDH（前體RNAs）檢測. C. MHC蛋白（綠色）和Charme RNA（紅色）在全分化的肌小管共染。D. sqRT-PCR檢測Charme在生長和分化條件下的表達情況。E. qRT-PCR檢測GAP-2、GAP-2/3或GAP-scr處理的分化的肌小管中的mCharme和pCharme、MCK、MHC的表達。F. GAP-2、GAP-2/3或GAP-scr處理的C2C12細胞中MHC進行免疫熒光染色。G. 定量GAP-2、GAP-2/3或GAP-scr處理的細胞中肌小管的形成。


2. Charme通過與nctc域相互作用調節(jié)肌形成

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圖2

A.RNA-seq分析Charme敲減后，轉錄本的改變。B. Charme敲減后，對上調或下調基因的GO富集分析。C. Charme敲減后，下調基因的KEGG富集分析。D. ChRIP實驗：富集的RNA（左圖）、富集的DNA（右圖）。E. 2天的分化肌小管中，對Charme RNA 和nctc進行RNA/DNA FISH（左圖）或lnc-31位點（右圖）。（I）表示二維圖片，（II）表示三維圖片，（III）表示Z軸旋轉。黃色箭頭代表重疊信號。F. 在GAP-scr- 和GAP-2-轉染的肌小管（2天分化）中，qRT-PCR檢測Charme和Charme靶基因的表達。G. 在GAP-scr- 和GAP-2-轉染的肌小管中，ChIP實驗檢測RNA Pol II（左）和H3K9ac（右圖）。在GAP-scr- 和GAP-2轉染的條件下，qPCR檢測回復的染色體和基因間的表達。


3. Charme與nctc域物理性靠近

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圖3

A.在肌小管生長和分化（DM1）條件下，Charme和nctc（上方）的雙鏈DNA和lnc-31位點（下方）的FISH實驗。B. GAP-scr- 和GAP-2-轉染的肌小管（DM1）中，Charme和nctc位點進行DNA/DNA FISH實驗。

 

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圖4. Charme-/-小鼠的產生和展示的骨骼肌表型

A.上圖： Charme位點和sgRNA1 and sgRNA2位置示意圖；下圖：單鏈ODN包含的2個同源性臂（灰線）100-nt-長的poly（A）/2×MAZ。B. qRT-PCR檢測來自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌勻漿中mCharme和pCharme的表達。C. 免疫熒光對來自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌組織中肌營養(yǎng)不良蛋白進行染色。D. qRT-PCR檢測來自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌中MHC和MCK轉錄本的表達。E. qRT-PCR檢測來自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌中Tnnt3、Tnni2和Igf2轉錄本的表達。
 

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圖5. Charme-/-小鼠展示出心臟表型

A.qRT-PCR檢測來自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠心臟勻漿中mCharme和pCharme的表達。B. 對1個月大Charme+/+小鼠（左圖）和Charme-/-小鼠（右圖）的心肌進行蘇木精和尹紅染色。C. 免疫熒光對來自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中心臟組織中肌營養(yǎng)不良蛋白進行染色。D. qRT-PCR檢測來自1個月的Charme+/+ 和Charme-/-小鼠心臟勻漿中Myh7、Tnnt2和Igf2轉錄本的表達。E. 1天大的Charme+/+ 和Charme-/-小鼠心臟組織中Charme和nctc位點的DNA/DNA FISH實驗。


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圖6.人Charme的特點與功能

A.帶有PCR引物（hs-2, hs-3)和LNA GAPmers (hs-GAP-int1, hs-GAP-ex2)的人Charme基因組位點。B. 在增殖（GM）和鑒別（3、6、10）條件下的健康和營養(yǎng)不良（DMD）源發(fā)性肌細胞中RT-PCR檢測人hs-pCharme（上圖）和hs-mCharme（下圖）的表達。C. aqRT-PCR檢測分化的肌小管中細胞質和細胞核中RNA片段中hs-pCharme和hs-mCharme的表達。D. PCR擴增分析hs-pCharme內含子1，對oligos的位置進行了描述。E. qRT-PCR檢測用hs-GAP-int1、hs-GAP-ex2或hs-GAPscr GAPmers處理分化5天的原代細胞中hs-mCharme、hs-pCharme、MCK、MHC、Igf2、Tnnt3、Tnni2、和Dmd mRNAs水平的表達。F. pCharme行為模式圖：在增生的成肌細胞中，Charme沒有被表達，它的染色質位點在空間上與nctc區(qū)域相距遙遠；在分化的肌小管中，pCharme穩(wěn)定在兩個位置的物理距離允許它們共同調控的表達式。