circPRMT5通過吸附miR-30c誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)膀胱癌的轉(zhuǎn)移

Circular RNAs (circRNAs)是一類新的，在人類癌癥中備受關(guān)注。但是其在癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的角色仍不清楚。本成果于2018年10月12日發(fā)表雜志Clin. Cancer Res（IF=10.2），在本研究中，作者的目的想識別新的circRNAs調(diào)節(jié)膀胱癌（UCB）細(xì)胞的EMT，探究他們的調(diào)節(jié)機(jī)制。首先UCB組織VS鄰近正常組織，做了circRNA芯片，篩選出了上調(diào)的circPRMT5。然后探究circPRMT5的功能和EMT機(jī)制。circPRMT5作為miRNA海綿體能夠吸附miR-30c，調(diào)節(jié)SNAIL1/E-cadherin通路，進(jìn)一步調(diào)節(jié)UCB細(xì)胞的惡性和EMT。并且作者進(jìn)一步識別了circPRMT5在UCB病人的血漿和尿液外泌體中也是上調(diào)的，并且與腫瘤轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。circPRMT5可以考慮作為UCB病人的預(yù)后biomarker和治療靶點(diǎn)。

技術(shù)路線

結(jié)果
1. CircRNAs在UCB組織中的表達(dá)譜和circPRMT5的特征。

圖1. CircPRMT5在UCBs中上調(diào)并與患者的不良預(yù)后相關(guān)

A, UBC組織 VS 鄰近的膀胱組織中，火山圖展示了circRNAs 的表達(dá)改變倍數(shù)，紅色代表顯著改變的circRNAs。B, 聚類圖展示，UBC組織 VS 鄰近的膀胱組織中，差異表達(dá)的circRNAs。C, 散點(diǎn)圖表示，UBC組織 VS 鄰近的膀胱組織中，circPRMT5的表達(dá)。D, 低 VS 高表達(dá)circPRMT5的病人進(jìn)行Kaplan-Meier曲線分析。E, 發(fā)散的和收斂的引物和F, Northern blots分析驗(yàn)證circPRMT5是circRNA。G, 核質(zhì)分離PCR 和H, FISH實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circPRMT5主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。

2. CircPRMT5 促進(jìn)UCB 細(xì)胞的惡性發(fā)展。

圖2. 沉默circPRMT5 能夠抑制UCB細(xì)胞的侵襲

A, 2個shRNA和示意圖和下調(diào)效果。B, circPRMT5過表達(dá)的效果。C和D，Wound healing assay展示下調(diào)circPRMT5能夠抑制UCB細(xì)胞的遷移，上調(diào)circPRMT5能夠促進(jìn)UCB細(xì)胞的遷移。E和F, Transwell assay下調(diào)circPRMT5能夠抑制UCB細(xì)胞的侵襲，上調(diào)circPRMT5能夠促進(jìn)UCB細(xì)胞的侵襲。G和H,裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)展示下調(diào)circPRMT5能夠抑制肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量或上調(diào)circPRMT5能夠促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量。

3. CircPRMT5誘導(dǎo)UCB細(xì)胞的EMT。

圖3. CircPRMT5激活SNAIL1通路誘導(dǎo)UCB細(xì)胞的EMT

A和B, Western blots 展示下調(diào)circPRMT5或上調(diào)circPRMT5后，EMT相關(guān)的marker表達(dá)情況。E-cadherin, Vimentin, N-cadherin, SNAIL1，PRMT5。C and D, 免疫熒光展示下調(diào)circPRMT5或上調(diào)circPRMT5后，EMT相關(guān)的marker表達(dá)情況，E-cadherin, Vimentin and N-cadherin。

4. CircPRMT5 在UCBs細(xì)胞中吸附miRNAs。

圖4. CircPRMT5在UCB細(xì)胞中吸附miR-30c

A, Ago2-RIP assay展示circPRM5顯著被富集。B, Luciferase reporter assay展示轉(zhuǎn)染shRNA后LUC-circPRMT5的活性。C, Luciferase reporter assay展示轉(zhuǎn)染83 miRNA mimicsLUC-circPRMT5的活性，進(jìn)一步識別與circPRMT5結(jié)合的miRNA。D, miRNAs 和circPRMT5結(jié)合位點(diǎn)示意圖。E, Luciferase reporter assay 展示轉(zhuǎn)染miRNA mimics后LUC-circPRMT5 or LUC-circPRMT5-mutant的活性。F和G, RNA pull down assay展示circPRMT5和 miR-30c和circPRMT5相結(jié)合。H, IF 展示circPRMT5和miR-30c能共定位在對照和過表達(dá)circPRMT5的細(xì)胞中。

5. CircPRMT5調(diào)節(jié)miR-30c/SANIL1/E-cadherin通路并促進(jìn)UCB細(xì)胞的惡性和EMT。

圖5. CircPRMT5封閉miR-30c的抑癌效應(yīng)

A和C,下調(diào)circPRMT5抑制細(xì)胞遷移(A) 侵襲(C)，這種現(xiàn)象能夠被加入miR-30c inhibitor后挽救。B and D, 上調(diào)circPRMT5促進(jìn)細(xì)胞遷移 (B) 侵襲 (D)，這種現(xiàn)象能夠被加入miR-30c mimics后挽救。E，下調(diào)circPRMT5抑制肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量，這種現(xiàn)象能夠被加入miR-30c inhibitor后挽救。 (F)，上調(diào)circPRMT5促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量，這種現(xiàn)象能夠被加入miR-30c mimic后挽救。G和H,下調(diào)circPRMT5抑制Vimentin, N-cadherin和SNAIL1/E-cadherin通路，這種現(xiàn)象能夠被加入miR-30c inhibitor后挽救。I和J, 上調(diào)circPRMT5促進(jìn)Vimentin, N-cadherin和SNAIL1/E-cadherin通路，這種現(xiàn)象能夠被加入miR-30c mimic后挽救。

6. CircPRMT5通過外泌體被釋放到UCB病人的血漿和尿液中并與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。

圖6. CircPRMT5被miR-30c/SANIL1/E-cadherin通路調(diào)節(jié)在UCB病人中

A, CircPRMT5與miR-30c的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。B, CircPRMT5與SNAIL1的表達(dá)呈正相關(guān)性。C, CircPRMT5與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。D, miR-30c的Kaplan-Meier curves分析。E, miR-30c在結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)情況。F, miR-30c與SNAIL1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。G, SNAIL1和E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。H, 本文的機(jī)制模型： circPRMT5吸附miR-30c調(diào)節(jié)SNAIL1/E-cadherin通路，促進(jìn)UCB細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移。