室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞釋放細(xì)胞外囊泡作為小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)原

室下區(qū)(SVZ)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)是圍產(chǎn)期神經(jīng)小生境的基礎(chǔ)。小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，在新生兒SVZ中富集。雖然小膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)NSCs，但這種相互作用的雙向程度尚不清楚。2018年4月，在Cell Report (IF=8.032)上發(fā)表的一篇名為“Neonatal Subventricular Zone Neural Stem Cells Release Extracellular Vesicles that Act as a Microglial Morphogen”就講述了神經(jīng)干細(xì)胞分泌的外泌體誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞變形的故事。SVZ NSCs生成和釋放EV，胞外囊泡(EVs)是包裹miRNA和蛋白的細(xì)胞源性顆粒。熒光標(biāo)記的EV融合蛋白由NSCs釋放，隨后從SVZ中清除。EV優(yōu)先針對微神經(jīng)膠質(zhì)。小RNA測序鑒定了EVs中調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞生理和形態(tài)的miRNA。EVs誘導(dǎo)細(xì)胞向CD11b/ Iba1非星狀小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變。轉(zhuǎn)錄時伴有小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，其特征是let -7調(diào)控的細(xì)胞因子釋放和控制NSC增殖的負(fù)反饋環(huán)。這些發(fā)現(xiàn)暗示了NSC細(xì)胞-EV-小膠質(zhì)細(xì)胞軸的存在。

技術(shù)路線

結(jié)果

1、新生SVZ NSCs釋放Evs分離與鑒定

原代SVZ NSCs培養(yǎng)為單層培養(yǎng)，從產(chǎn)后0 (P0)小鼠開始，對NSC標(biāo)記蛋白Nestin進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)實驗。新生兒SVZ培養(yǎng)物為DCX陰性，而大多數(shù)細(xì)胞為巢蛋白陽性(92%)(圖1A)。對新生的SVZ NSC培養(yǎng)基進(jìn)行低速離心，，然后進(jìn)行納米顆粒跟蹤分析。 (圖1 B)。NSC EV大小經(jīng)電鏡證實為外泌體形態(tài)(圖1C)。CD63是EV標(biāo)記蛋白，證實在NSCs和EV中表達(dá)(圖1D)。另一種EV蛋白CD9在背前腦提取物中被檢測到。新生兒大腦中存在CD9, P7上調(diào)(圖- 1E)。western blot檢測原發(fā)性新生兒SVZ NSC EVs中CD9(圖1F)。此外，SVZ NSC EV中還存在外泌體貨運(yùn)蛋白ALIX(圖1G)。CD9表達(dá)在原發(fā)性SVZ NSC培養(yǎng)基中通過免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)一步證實(圖1H和1I)。為了檢測體內(nèi)CD9蛋白的表達(dá)，作者對P0和P4大腦進(jìn)行了免疫組化。P4時，在巢蛋白陽性的NSCs中，CD9表達(dá)沿著心室壁傳輸(圖1J-1L)。在新生兒SVZ中CD9的富集與Allen腦研究所矢狀切片原位雜交相一致(圖1M)。這些結(jié)果都證實了新生兒SVZ神經(jīng)干細(xì)胞釋放胞外囊泡的存在。

2. 體內(nèi)實驗證明SVZ NSCs釋放CD9

為了研究NSC外泌體，將番茄熒光蛋白和CD9-GFP編碼質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至P0小鼠SVZ，并檢測NSCs(圖2A)。在整個體細(xì)胞中檢測到番茄熒光蛋白的表達(dá)(圖2B-2D)。CD9-GFP陽性細(xì)胞在腹外側(cè)心室壁最常見(圖2B - 2D)。CD9-GFP在具有b1樣NSC形態(tài)的細(xì)胞中被檢測到(圖2E-2H)。CD9-GFP定位于頂端和基質(zhì)的過程(圖2E和2I)。P7對膠質(zhì)原纖維酸蛋白(GFAP)的NSC形態(tài)學(xué)染色呈陽性(圖2J和2K)。b1樣的番茄/CD9-GFP-陽性細(xì)胞也呈巢蛋白陽性，證實其為NSCs(圖2L和2M)。在電穿孔細(xì)胞外檢測到CD9-GFP(圖2N和2O)。檢測到52個番茄陽性細(xì)胞/SVZ 48小時后電循環(huán)(圖2P)。SVZ中殘存的番茄陽性細(xì)胞較P2-P7明顯減少80%(圖2P)。，在P7時，共表達(dá)CD9-GFP和番茄的細(xì)胞百分比從24%顯著降低到7.32%(圖2Q)。在P21-P28的大腦中，CD9-GFP/番茄共表達(dá)細(xì)胞百分比的降低是相似的。考慮到番茄陽性細(xì)胞的減少，與番茄/CD9-GFP雙陽性細(xì)胞一致，這些結(jié)果支持了71%的CD9-GFP/番茄陽性細(xì)胞為NSCs的模型。每個電穿孔細(xì)胞電孔48小時后，至少可檢測到一個細(xì)胞外顆粒(54.77 CD9-GFP顆粒/圖像)(圖2R)。在P21-P28小鼠中，共電穿孔番茄NSCs外的CD9- GFP顆粒數(shù)在電穿孔后7天內(nèi)下降至18.20個顆粒，且保持相似(19.06)(圖2R)。這些結(jié)果表明SVZ NSCs釋放CD9, CD9可以從細(xì)胞外環(huán)境中次序的被清除。

3.SVZ神經(jīng)干細(xì)胞胞外囊泡EV是針對小膠質(zhì)細(xì)胞的

iba1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞與來自新生SVZ NSC細(xì)胞外CD9- GFP共定位(圖3A和3B)。作為一項初步實驗，為了進(jìn)行更公正的評估，將轉(zhuǎn)染CD9- GFP N2a細(xì)胞的外泌體用熒光親脂染料DiI標(biāo)記。然后將外泌體注射入新生兒小鼠的側(cè)腦室(圖3C)。注射后一到七天，老鼠被收集，大腦被分離。側(cè)腦室附近的細(xì)胞群用DiI和GFP標(biāo)記(圖3D-3E)。細(xì)胞偶有星狀形態(tài)，類似于小膠質(zhì)細(xì)胞(圖3F)。Iba1染色證實這些細(xì)胞是小膠質(zhì)細(xì)胞(圖3F)。用DiI標(biāo)記P100組分的SVZ NSC EVs，并將其注射到P0小鼠體內(nèi)。NSC EVs主要針對iba1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞(圖3H)。EV標(biāo)記的小神經(jīng)膠質(zhì)常呈圓形，常與側(cè)腦室和SVZ相鄰。CD68和CD11b是新生SVZ小膠質(zhì)細(xì)胞外壓的兩個小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，dii標(biāo)記的細(xì)胞對CD68和Iba1以及CD11b和Iba1呈雙重陽性(圖3I-3K)。

4.神經(jīng)干細(xì)胞胞外囊泡和RNA含量調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)

為了確定EVs對小膠質(zhì)細(xì)胞的功能影響，進(jìn)行了小RNA測序。在NSC P100 EV中發(fā)現(xiàn)了大量的miRNA，大于平均miRNA的10倍(圖4A)。miR-9、Let-7、miR-26和miR-181在NSC EV中高度富集。都在調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和生理方面發(fā)揮作用.假設(shè)EVs調(diào)控cd11b陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞以誘導(dǎo)圓形非星狀表型(圖4B)。與對側(cè)半球相比，NSC P100 EV移植增加了cd11b陽性小膠質(zhì)細(xì)胞(圖4C和4D)。與對照組相比，UV預(yù)處理EVs導(dǎo)致cd11b陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞減少(圖4E)。作者推測外源體Let-7可能調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。收集轉(zhuǎn)染Let-7的N2a細(xì)胞外泌體。體外酶體經(jīng)過模擬或合成Let-7轉(zhuǎn)染，移植到新生小鼠SVZ中。經(jīng)合成的Let-7 miRNA轉(zhuǎn)染的外泌體誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞獲得了一種與MIMICS轉(zhuǎn)染外泌體不同的圓形外觀(圖4I-4L)。這些結(jié)果證實SVZ NSCs釋放的外泌體是針對小膠質(zhì)細(xì)胞的、被小膠質(zhì)細(xì)胞吸收和修飾的。

5. NSC EVs激活小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，形成NSC反饋回路

NSC EVs激活小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò), NSC EVs處理的小膠質(zhì)細(xì)胞有1713個轉(zhuǎn)錄本上調(diào)大于2倍(圖5A)。GO分析表明，免疫系統(tǒng)過程和炎癥反應(yīng)是最豐富和最顯著的表達(dá)(圖5B)。熱圖中轉(zhuǎn)錄本的檢測顯示，上調(diào)程度最高的轉(zhuǎn)錄本包括白細(xì)胞介素-1a (IL-1a)、IL-1b和IL-6等細(xì)胞因子(圖5C)。與此一致的是，對頂端差異調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本的網(wǎng)絡(luò)分析包括了該網(wǎng)絡(luò)核心的一個細(xì)胞因子節(jié)點(diǎn)(圖5D)。細(xì)胞因子的上調(diào)在小膠質(zhì)條件培養(yǎng)基中得到驗證(圖5E)。合成的含有l(wèi)et -7的EV可以刺激模擬NSC EVs作用的小膠質(zhì)細(xì)胞因子的強(qiáng)力釋放(圖5F)。為了驗證小膠質(zhì)細(xì)胞攝取NSC外泌體的功能意義，將未處理或EV處理的小膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基注射回P0小鼠側(cè)腦室，并進(jìn)行EdU標(biāo)記(圖5G)。由外泌體處理的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基，但不能控制小膠質(zhì)細(xì)胞，減少了分裂NSCs的數(shù)量(圖5H)。綜上所述，這些結(jié)果表明外泌體對新生兒時期小膠質(zhì)細(xì)胞信號通路的影響是顯著的。