外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)lncRNA-PTENP1抑制膀胱癌的進(jìn)展

即使外泌體能夠包裝長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs）去調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的交流，但是外泌體lncRNA PTENP1在膀胱癌（BC）中的角色還不清楚。鑒于這一點(diǎn)，Jing Qian和Zhengdong Zhang等人帶領(lǐng)他們的團(tuán)隊(duì)，研究了外泌體lncRNA-PTENP1在BC中的角色，并將研究成果于2018年10月3日發(fā)表在了Molecular Cancer雜志（IF=7.76）上。在本次研究中，作者首先檢測(cè)了PTENP1在BC和健康對(duì)照組的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PTENP1發(fā)生在組織和血漿外泌體中。通過(guò)ROC和AUC分析，作者評(píng)估了PTENP1的診斷準(zhǔn)確度。為了決定外泌體PTENP1的功能，作者做了細(xì)胞表型和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)PTENP1在BC病人組織和BC病人來(lái)源的血漿外泌體中顯著下調(diào)；作者發(fā)現(xiàn)PTENP1主要被外泌體包裝。外泌體PTENP1在BC病人和健康對(duì)照組中不同。正常細(xì)胞分泌的外泌體PTENP1，并且能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)運(yùn)到BC細(xì)胞中，因此通過(guò)細(xì)胞凋亡和降低細(xì)胞遷移和侵襲能力抑制BC細(xì)胞的惡性行為。在體內(nèi)，外泌體PTENP1能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)。外泌體PTENP1能夠通過(guò)結(jié)合miR-17調(diào)節(jié)PTENP1的表達(dá)。因此，作者得出結(jié)論，外泌體PTENP1可以考慮作為BC治療的一個(gè)新的biomarker。來(lái)源于正常細(xì)胞的外泌體能夠?qū)TENP1轉(zhuǎn)運(yùn)到BC細(xì)胞中，能夠在體內(nèi)體外降低BC的緊張。在BC致癌過(guò)程中，外泌體PTENP1能夠參與正常細(xì)胞到膀胱細(xì)胞的交流。

技術(shù)路線

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 血漿外泌體lncRNA- PTENP1在膀胱癌中顯著，并且可以考慮作為膀胱癌的biomarker

圖1 血漿外泌體PTENP1在BC病人中的表達(dá)。

A. 外泌體的顯微圖片。B. WB檢測(cè)外泌體的marker(TSG和CD63)。C. qRT-PCR檢測(cè)外泌體PTENP1的表達(dá)。E. 在0、4、8、24h的血漿外泌體中PTENP1的表達(dá)。F. 外泌體PTENP1反復(fù)凍融0、2、4、8次后檢測(cè)外泌體PTENP1的表達(dá)。

2. 過(guò)表達(dá)PTENP1能夠抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲 

圖2 PTENP1在BC細(xì)胞表型的效應(yīng)。

EJ和J82細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PTENP1表達(dá)質(zhì)?；騈C載體。A. qRT-PCR檢測(cè)PTENP1在mRNA水平上的表達(dá)。B. CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的活性。C. 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力。D. transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EJ和J82細(xì)胞的侵襲能力。E. transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EJ和J82細(xì)胞的遷移能力。F.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EJ和J82細(xì)胞的凋亡能力。G. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EJ和J82細(xì)胞的細(xì)胞周期。

3. 膀胱癌細(xì)胞能夠攝取正常細(xì)胞分泌的外泌體

圖3 外泌體PTENP1作為細(xì)胞內(nèi)交流調(diào)節(jié)器。

外泌體從293A, J82和EJ細(xì)胞中分離。A. qRT-PCR檢測(cè)加入 RNase (2 μg/ml)和共同加入Triton X-100 (0.1%) 20min后，293A, J82和EJ細(xì)胞培養(yǎng)基中PTENP1的表達(dá)。B. 293A, J82和EJ細(xì)胞培養(yǎng)基中分離的外泌體的顯微圖片。C. WB檢測(cè)細(xì)胞系中的外泌體的marker（TSG101和CD63）。D. qRT-PCR檢測(cè)293A, J82和EJ細(xì)胞培養(yǎng)基中外泌體PTENP1的改變倍數(shù)。E. 293A細(xì)胞外泌體被PKH67標(biāo)記后孵育J82和EJ細(xì)胞3h。

4. 過(guò)表達(dá)外泌體PTENP1能夠抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲

圖4 外泌體PTENP1對(duì)膀胱癌細(xì)胞表型中的影響。

外泌體從轉(zhuǎn)染PTENP1表達(dá)質(zhì)粒和NC載體的293A細(xì)胞中分離。293A細(xì)胞的外泌體分離后孵育EJ和J82細(xì)胞24h。A. CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的活性。B. qRT-PCR檢測(cè)PTENP1在mRNA水平上的表達(dá)。C. 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力。D. transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EJ和J82細(xì)胞的侵襲能力。E. transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EJ和J82細(xì)胞的遷移能力。F.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EJ和J82細(xì)胞的凋亡能力。G. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EJ和J82細(xì)胞的細(xì)胞周期。

5. 體內(nèi)上調(diào)PTENP1或外泌體PTENP1都能抑制膀胱癌的發(fā)展

圖5 在體內(nèi)過(guò)表達(dá)PTENP1和外泌體PTENP1對(duì)腫瘤的影響。

過(guò)表達(dá)PTENP1和外泌體PTENP1轉(zhuǎn)染到EJ細(xì)胞中，命名為NC、PTENP1 vector。外泌體從轉(zhuǎn)染PTENP1/NC病毒載體的293A細(xì)胞中分離，命名為NC-Exos 、PTENP1-Exos。A. 接種NC, PTENP1-Exos, PTENP1 vector和NC-Exos后的裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)。B. 接種NC, PTENP1-Exos, PTENP1 vector和NC-Exos后的異種移植實(shí)驗(yàn)。C. 每?jī)商鞕z測(cè)腫瘤的體積。D. 每15天檢測(cè)終究得中重量。E. qPCR檢測(cè)接種NC, PTENP1-Exos, PTENP1 vector和NC-Exos后檢測(cè)裸鼠腫瘤中的PTENP1和PTENP的表達(dá)。F. HE染色和免疫組化分析ki67和PTENP在腫瘤組織中的表達(dá)。

6. PTENP1通過(guò)吸附miR-17上調(diào)PTEN的表達(dá)

圖6 外泌體PTENP1通過(guò)miR-17調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)。

A. WB檢測(cè)轉(zhuǎn)染PTENP1表達(dá)質(zhì)粒和NC載體的EJ和J82細(xì)胞中PTEN的表達(dá)。B. WB檢測(cè)轉(zhuǎn)染外泌體PTENP1和外泌體NC的EJ和J82細(xì)胞中PTEN的表達(dá)。C. miR-17結(jié)合PTENP的3’-UTR。D. WB檢測(cè)轉(zhuǎn)染外泌體PTENP1和miR-17 mimics的EJ和J82細(xì)胞中PTEN的表達(dá)。

7. 在膀胱癌細(xì)胞中，來(lái)自于轉(zhuǎn)染PTENP1載體的正常細(xì)胞中的外泌體PTENP1能夠提高PTENP1的表達(dá)

圖7 外泌體PTENP1調(diào)節(jié)的膀胱癌進(jìn)展的示意圖。

外泌體PTENP1通過(guò)ceRNA機(jī)制，吸附miR-17和調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)，進(jìn)一步抑制膀胱癌的進(jìn)展。