高分文章揭示，CAFs外泌體miRNA介導(dǎo)腫瘤耐藥

順鉑耐藥是晚期頭頸部腫瘤(HNC)的一大挑戰(zhàn)，為攻克晚期頭頸部腫瘤(HNC)的難關(guān)，了解順鉑耐藥的潛在機(jī)制成為了當(dāng)務(wù)之急。

2019年1月14日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院在《Genome Biology》雜志上發(fā)表了題為“Exosomal miR-196a derived from cancerassociated fibroblasts confers cisplatin resistance in head and neck cancer through targeting CDKN1B and ING5”的文章，IF=13.21。

這項研究揭示了CAF衍生外泌體miR-196a賦予 HNC順鉑耐藥的原理，并為miR-196a可能作為HNC中順鉑耐藥的預(yù)測因子和潛在治療靶點(diǎn)提供了理論基礎(chǔ)。

背景：順鉑耐藥是晚期頭頸部腫瘤(HNC)的一大挑戰(zhàn)。臨床迫切需要了解順鉑耐藥的潛在機(jī)制，并制定有效的策略。然而，腫瘤間質(zhì)如何調(diào)控HNC生長和耐藥尚不清楚。

結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)對順鉑具有固有的耐藥性，并通過將將功能外泌體miR-196a從CAFs傳遞到腫瘤細(xì)胞，從而在調(diào)控HNC細(xì)胞的存活和增殖方面發(fā)揮積極作用。然后，外泌體miR-196a結(jié)合新的靶細(xì)胞CDKN1B和ING5，賦予HNC細(xì)胞順鉑耐藥性。CAFs損耗的外泌體或外泌體miR-196a功能性地恢復(fù)HNC的順鉑敏感性。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)miR-196a 包裝成CAF衍生外泌體可能是由異質(zhì)性核核糖核酸蛋白A1 (hnRNPA1)介導(dǎo)的。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，高水平的血漿外泌體miR-196a在臨床上與較差的總體生存率和化療耐藥性相關(guān)。

結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)，CAF衍生外泌體miR-196a通過靶向CDKN1B和ING5賦予 HNC順鉑耐藥，這提示我們miR-196a可能作為HNC中順鉑耐藥的預(yù)測因子和潛在治療靶點(diǎn)。

研究結(jié)果：

Fig. 1 HNC衍生的CAFs對順鉑具有天然的耐藥特性。

a 免疫熒光染色,α-SMA FAP, FSP1 在NFs和CFAs 的表達(dá)(比例尺,20μm)。 b 免疫印跡分析α-SMA、FAP和FSP1在六個配對NFs和CAFs的蛋白質(zhì)含量 。c NFs、CAFs和HNC細(xì)胞有無被10μM順鉑治療8天,并且測量細(xì)胞生存能力獲得細(xì)胞生存和規(guī)范化的百分比控制細(xì)胞。d NFs、CAFs和HNC細(xì)胞有無被10μM 順鉑治療24 h，并且檢測細(xì)胞生存能力來計算在順鉑治療下增殖細(xì)胞的百分比。e在10μM順鉑治療8天的條件下，存活的CAFs的百分比(CAF3)和有順鉑耐藥性HN4-res細(xì)胞,表現(xiàn)出相似的保留擴(kuò)散率。 f, g蛋白質(zhì)印記檢測NFs、CAFs、CAL 27、sc -25、HN4、HN4-res細(xì)胞中MRP2、ATP7B、CTR1、XIAP、ERCC1、ERCC4、GSTK1、Bcl-2蛋白水平。并對頻帶強(qiáng)度進(jìn)行評估。(ns, 無顯著性差異; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p<0.001; ****p < 0.0001)

Fig. 2 CAF衍生的外泌體增加HNC細(xì)胞增殖和順鉑耐藥。

a分別在CAF -CM和對照CM中培養(yǎng)CAL 27 和 HN4細(xì)胞6天，觀察細(xì)胞存活率。b分別在CAF -CM和對照CM中培養(yǎng)CAL 27和HN4細(xì)胞6天，然后進(jìn)行MTT檢測這些細(xì)胞的順鉑反應(yīng)。c,在對照CM、ca -CM或外泌體缺失的ca -CM中分別在對照CM、CAF-CM或者外泌體損耗的CAF-CM中培養(yǎng)c27和HN4細(xì)胞6天，并檢測細(xì)胞存活率。采用MTT法檢測這些細(xì)胞對順鉑的耐受性。d, 將HNC細(xì)胞與DMSO處理的HNC細(xì)胞、DMSO處理的 CAFs或GW4869處理的CAFs共培養(yǎng)6天，然后評估HNC細(xì)胞的存活率。采用MTT法測定順鉑治療后共培養(yǎng)HNC細(xì)胞的存活率。e采用NanoSight粒子追蹤分析CAFs或順鉑治療的CAFs的粒度分布和數(shù)量  f采用NanoSight粒子追蹤分析NFs, CAFs, 和有或沒有接受順鉑(10 μM)治療的 HNC 細(xì)胞的數(shù)量。 g來自NFs、CAFs,和有或沒有接受順鉑(10μM)治療的HNC細(xì)胞中CM的核外蛋白質(zhì)濃度。 h用來自CAFs的 DiO外泌體示蹤(25 μg/mL)液培育CAL 27和 HN4細(xì)胞24 h,并使用共焦顯微鏡(比例尺,20μm)檢測綠色的外泌體信號。 i流式細(xì)胞檢測分析按照規(guī)定時間在來自CAFs的 DiO外泌體示蹤(25 μg/mL)液中培育的Dio陽性CAL 27 or HN4 cells細(xì)胞。 j 用來自HNC細(xì)胞, CAFs, 或者順鉑(10 μM)治療的CAFs的外泌體(25 μg/mL) 處理HNC細(xì)胞 6天。檢測細(xì)胞活力，并進(jìn)行MTT檢測，以鑒定這些細(xì)胞的順鉑反應(yīng)。k 用來自HNC 細(xì)胞，順鉑(10 μM)治療的HN4-res細(xì)胞，或者 順鉑治療的(10 μM) CAFs 的外泌體(25 μg/mL) 處理HNC細(xì)胞6天。用MTT法測定這些細(xì)胞的存活率和存活率。(NT, 沒有順鉑治療; CT, 順鉑治療; ns, 無顯著差異; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p<0.001; ****p < 0.0001)

Fig. 3 miR-196a從CAFs外體轉(zhuǎn)移到HNC細(xì)胞。

a采用real-time PCR技術(shù)分析miR-196a在NFs、CAFs、正?？谇簧掀ぜ?xì)胞(冠名正常)、原發(fā)性癌細(xì)胞和HNC細(xì)胞系中的表達(dá)。 b 將CAL27和HN4細(xì)胞分別在對照CM、CAF-CM或外泌體損耗的CAF -CM中培育24 h, 使用real-time PCR檢測細(xì)胞中miR-196a的表達(dá)水平。c 將CAL 27和 HN4細(xì)胞與DMSO-處理的HNC 細(xì)胞， DMSO處理的CAFs，或者GW4869處理的CAFs共培養(yǎng)24 h,然后使用 real-time PCR檢測miR-196a在HNC細(xì)胞中的表達(dá)水平。 d 被 Cy3標(biāo)記的miR-196a (Cy3-miR-196a) 暫時性轉(zhuǎn)染的CAFs與CAL 27或HN4細(xì)胞共培養(yǎng)48 h。用熒光顯微鏡來檢測HNC細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光信號(比例尺,20μm)。 e 使用Real-time PCR分析miR-196a在被RNase A (2mg/mL)單獨(dú)處理或與Triton X-100 (0.1%) 聯(lián)合處理 20分鐘的CAF-CM t內(nèi)的表達(dá)。f Real-time PCR分析miR-196a在來源于CAFs的外泌體、外泌體損耗的CM和整個CM中的表達(dá)。g被來源于HNC細(xì)胞 (Ctrl Exos)，CAFs， 或者有或沒有被miR-196a模仿 轉(zhuǎn)染的CAFs 外泌體(25 μg/mL)培育24h后用real-time PCR檢測miR-196a在CAL 27和 HN4細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。  h被來源于HNC細(xì)胞 (Ctrl Exos) ，CAFs， 或者有或沒有被anti-miR-196a轉(zhuǎn)染的CAFs 外泌體 (25 μg/mL) 培育24h后用real-time PCR檢測miR-196a在CAL 27和 HN4細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。 i, j and the cisplatin response in these cells was determined with MTT assays. 用指定的外泌體(25 μg/mL)處理CAL 27和HN4細(xì)胞6天，用MTT檢測這些細(xì)胞的順鉑反應(yīng)。(ns, 無顯著性差異; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p<0.001; ****p < 0.0001)

Fig. 4 hnRNPA1蛋白介導(dǎo)miR-196a包裝成CAF衍生的外泌體。

a 通過RBPDB分析預(yù)測miR-196a序列與RBP 基序之間的特異性相互作用(閾值0.7)。 b轉(zhuǎn)染特異性siRNAs 48 h后，ZRANB2、hnRNPA1和ELAVL1在CAFs中的表達(dá)水平的蛋白印記和real-time PCR結(jié)果顯示。 c用real-time PCR檢測特定siRNAs 靶向轉(zhuǎn)染ZRANB2、hnRNPA1或ELAVL1的CAFs外泌體中miR-196a的表達(dá)。 d Real-time PCR分析顯示miR-196a在hnRNPA1沉默的CAFs中表達(dá)。e蛋白印記對于 hnRNPA1在由細(xì)胞核miRNA下調(diào)、細(xì)胞質(zhì)、外泌體CAFs裂解物以及生物素化指示的miR-196a或突變miR-196a衍生的樣品中的表達(dá)分析；生物素化聚(G)作為陰性對照。 f 用 anti-hnrnpa1抗體(或IgG作為對照)對細(xì)胞或體外溶出物進(jìn)行RIP檢測。real-time PCR檢測免疫沉淀樣品中miR-196a水平，并報告其相對于輸入樣品的百分比(%輸入)。 g RIP法測定經(jīng)順鉑處理或不經(jīng)順鉑處理的CAFs細(xì)胞質(zhì)或外體裂解物中miR-196a相對于IgG的hnRNPA1富集。h 在同時被Cy3-miR-196a 和 特定的 siRNAs 靶向hnRNPA1轉(zhuǎn)染的CAFs 中共培養(yǎng)CAL 27和HN4細(xì)胞48 h。用熒光顯微鏡是檢測HNC細(xì)胞中的紅色熒光信號(比例尺,10μm)。 i用混合的CAL 27細(xì)胞加hnRNPA1、sh-NC或sh-hnRNPA1轉(zhuǎn)染的CAFs進(jìn)行裸鼠皮下異種移植，顯示腫瘤生長曲線和腫瘤體積。 j FISH法檢測miR-196a在異種移植瘤中的分布情況，并檢測miR-196a在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況。 k 108對HNC樣本及鄰近正常組織中hnRNPA1 mRNA表達(dá)水平。HNC組織中miR-196a表達(dá)與hnRNPA1表達(dá)的l相關(guān)性分析(n = 108) (NT, 未經(jīng)順鉑治療; CT, 順鉑治療; *p< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001)

Fig. 5 miR-196a通過促進(jìn)G1/S的過渡和凋亡抗性來調(diào)控HNC細(xì)胞的增殖和存活。

a miR-196a或anti-miR-196a轉(zhuǎn)染48 h后，用CAL 27細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。 b miR-196a或anti-miR-196a轉(zhuǎn)染48 h后，具有代表性的顯微圖和包含edu合并細(xì)胞的定量。 c MTT法檢測miR-196a或anti-miR-196a轉(zhuǎn)染48 h的CAL 27細(xì)胞，然后在指定濃度下順鉑處理72 h。 d順鉑(3μM)治療條件下被miR-196a和anti-miR-196a轉(zhuǎn)染的CAL 27細(xì)胞的平板集落形成試驗。 e轉(zhuǎn)染48 h后，流式細(xì)胞儀分析miR-196a或anti-miR-196a轉(zhuǎn)染的CAL 27細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。f, g在miR-196a和anti-miR-196a轉(zhuǎn)染的CAL 27細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，使用流式細(xì)胞術(shù)分析順鉑(10μM)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。(*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)

Fig. 6 CDKN1B和ING5是HNC細(xì)胞外泌體miR-196a的直接靶細(xì)胞。

a基因本體論分析miR-196a預(yù)測候選靶基因示意圖。 b miR-196a或anti-miR-196a轉(zhuǎn)染 48 h后，CDKN1B和ING5 mRNA在CAL 27和HN4細(xì)胞中的表達(dá)。 c在HNC 細(xì)胞 (Ctrl Exos) 和 CAFs分泌.的外泌體 (25 μg/mL)內(nèi)培育48h后CAL 27 and HN4細(xì)胞內(nèi)的CDKN1B 和ING5 mRNA水平  d, e HNC組織中miR-196a表達(dá)與CDKN1B或ING5表達(dá)的相關(guān)性分析(n = 108)。 f 預(yù)測CDKN1B和ING5基因3’UTRs中miR-196a靶序列。g miR-196a和熒光素酶報告基因共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，CDKN1B或ING5報告基因的相對活性。h anti-miR-196a 對293T細(xì)胞內(nèi)CDKN1B或ING5報告基因熒光素酶活性的影響。i f CAF衍生外泌體 (25 μg/mL) 對293T細(xì)胞內(nèi)CDKN1B或ING5報告基因熒光素酶活性的影響。j顯示miRNA靶細(xì)胞免疫沉淀程序的圖表。 k 靶轉(zhuǎn)錄本與miR-196a的相互作用。用生物素化的miRNC或miR-196a 轉(zhuǎn)染CAL 27或HN4細(xì)胞48 h。通過real-time PCR和 規(guī)范化的β-actin分析 CDKN1B和ING5 mRNA在被biotin-miR-196a下拉的材料中的水平。 l. p27 and ING5 expression in the indicated cells  miR-196a 或 anti-miR-196a轉(zhuǎn)染，或用CAF衍生外泌體 (25 μg/mL)培育的CAL 27和 HN4細(xì)胞24h。用蛋白質(zhì)印記檢測指定細(xì)胞內(nèi)p27和ING5表達(dá)。 m轉(zhuǎn)染48 h后，被miR-NC, 加上控制向量的 miR-196a r, 加上CDKN1B質(zhì)粒的miR-196a, 或者加上ING5 質(zhì)粒miR-196a的轉(zhuǎn)染的HNC細(xì)胞細(xì)胞周期和順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分析的結(jié)果。(ns, 無顯著性差異; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)

Fig. 7 miR-196a通過下調(diào)CDKN1B和ING5，加速HNC細(xì)胞對順鉑的耐藥。

a  蛋白質(zhì)印跡檢測顯示CDKN1B特異性轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，CAL l27和HN4細(xì)胞中p27、p21、CDK2、CDK4、Cyclin D1和Cyclin E1的蛋白水平。 b蛋白質(zhì)印跡檢測顯示ING5特異性轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，CAL 27和HN4細(xì)胞中ING5、Bcl-2、Bax、全長Caspase 3、裂解的Caspase 3、全長PARP和裂解的PARP的蛋白水平。 c 左圖： transfection with siRNAs specific for CDKN1B or ING5. 蛋白質(zhì)印跡檢測顯示siRNAs特異性轉(zhuǎn)染CDKN1B或ING5 48小時后，CAL 27和HN4細(xì)胞中p27和ING5的蛋白水平。 右圖：如圖所示，MTT法顯示轉(zhuǎn)染48小時后CAL 27和HN4細(xì)胞順鉑反應(yīng)。 d 左圖：蛋白質(zhì)印跡檢測顯示同時轉(zhuǎn)染miR-196a和外源性表達(dá)載體(CDKN1B或ING5) 48 h后，CAL 27和HN4細(xì)胞中p27和ING5的蛋白水平。.右圖：如圖所示，轉(zhuǎn)染48小時后，CAL 27和HN4細(xì)胞的順鉑反應(yīng)。e左圖：蛋白質(zhì)印跡檢測顯示轉(zhuǎn)染anti-miR-196a和針對于CDKN1B或ING5的 siRNAs 48 h后，CAL 27和HN4細(xì)胞中p27和ING5的蛋白水平。右圖：如圖所示，轉(zhuǎn)染48小時后，CAL 27和HN4細(xì)胞的順鉑反應(yīng)。f 左圖： 蛋白質(zhì)印跡檢測顯示轉(zhuǎn)染miR-196a和外源性表達(dá)載體(CDKN1B或CDKN1B 3’UTR) 48 h后，CAL 27和HN4細(xì)胞中p27蛋白水平。 右圖： 如圖所示，轉(zhuǎn)染48小時后，CAL 27和HN4細(xì)胞出現(xiàn)順鉑耐藥性。G左圖：蛋白質(zhì)印跡檢測顯示被miR-196a和外源性表達(dá)載體(ING5或ING5 3’UTR) 轉(zhuǎn)染48 h后，CAL 27和HN4細(xì)胞中ING5的蛋白水平。右圖：如圖所示，轉(zhuǎn)染48小時后，CAL 27和HN4細(xì)胞出現(xiàn)順鉑耐藥性。 (ns,無顯著性差異; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)

Fig. 8 CAF 衍生的外泌體miR-196a在體內(nèi)增強(qiáng)HNC細(xì)胞對順鉑的耐藥性

a用有或無CAFs的CAF 27細(xì)胞建立異種移植小鼠模型。小鼠腹腔注射順鉑(4mg/kg，每4天注射一次)，加或不加GW4869 (2 mg/kg，每2天注射一次)。顯示腫瘤生長曲線、腫瘤體積和腫瘤重量。 b穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染miR-196a的CAL 27細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-196a或anti-miR-196a的CAFs細(xì)胞。裸鼠皮下移植預(yù)轉(zhuǎn)染的CAL 27細(xì)胞或CAFs。小鼠腹腔注射順鉑5次(4mg/kg，每4天一次)。顯示腫瘤生長曲線、腫瘤體積和腫瘤重量。 c miR-196a水平上調(diào)與HNC組織中腫瘤大小增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期腫瘤分期有關(guān)。 d Real-time PCR分析顯示miR-196a在化療敏感患者(n = 20)和化療耐受患者(n = 20)的HNC組織中的表達(dá)。 e Kaplan-Meier總體生存分析。與低miR-196a表達(dá)的患者相比，高miR-196a表達(dá)的患者總體生存率明顯較低。 f 采用real-time PCR技術(shù)檢測HNC患者和健康獻(xiàn)血者血漿外體miR-196a水平。 g HNC患者術(shù)前和術(shù)后匹配血漿中miR-196a的Real-time PCR分析(n = 40)。 h 對化療敏感(n = 20)和化療耐受(n = 20)患者血漿中miR-196a核外表達(dá)的Real-time PCR分析。i Kaplan-Meier法分析74例HNC患者的總生存率，根據(jù)治療前血漿中miR-196a的外泌體中位水平，分為高miR-196a組和低miR-196a組。 j, 血漿外體miR-196a表達(dá)的ROC曲線分析，用于區(qū)分化學(xué)耐受組(n = 20)和化學(xué)敏感組(n = 20)。AUC,曲線下面積。 k一個說明CAF衍生的外泌體miR-196a對HNC細(xì)胞增殖和順鉑耐藥的調(diào)節(jié)作用的模型。 (*p< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p< 0.0001)