模擬微重力對人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中RNA表達譜的影響

有研究表明微重力顯著引起負重骨的骨質(zhì)每月流失約為1％-2％。重力是成骨細胞形成、分化以及維持骨骼組織的重要因素。人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBMSc)是成人骨髓中的一類多能干細胞。它具有增殖和分化為不同間充質(zhì)組織的潛能，在正常重力作用下，hBMsc可以在特定誘導(dǎo)條件下分化為成骨細胞，而微重力抑制了hBMsc向成骨細胞分化。那么微重力對hBMsc分化過程中RNA表達有何影響呢？2018年11月一篇發(fā)表在《Cell Proliferation》上的《Effects of simulated microgravity on the expression profiles of RNA during osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells》文章研究了微重力對人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中RNA表達譜的影響，揭示了hBMSCs在正?；颍∟G）和模擬微重力（SMG）下的基因表達模式，該研究為利用基因調(diào)控手段降低微重力下人內(nèi)體成骨形成和降低骨量流失提供思路。
摘要：
目的：暴露于微重力誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞（hBMSCs）的許多適應(yīng)性和病理學(xué)變化。但是，人們對這些變化的潛在機制了解甚少。我們揭示了hBMSCs在正?；颍∟G）和模擬微重力（SMG）下的基因表達模式，并通過基因調(diào)控和信號通路分析對這些變化進行解釋。
材料和方法：在這項研究中，hBMSCs在正常地面重力和模擬微重力下成骨誘導(dǎo)0,2,7和14天，然后通過RNA測序分析成骨分化過程中轉(zhuǎn)錄組表達的差異以及這些結(jié)果的一些實驗驗證。
結(jié)果：分別在2,7和14天樣本中鑒定出837，399和894個差異表達基因（DEGs），其中13個基因被選擇用于qRT-PCR分析以確認RNA測序結(jié)果。經(jīng)過分析，我們發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)早期抑制了增殖。在中期，成骨分化受到抑制，而SMG 促進脂肪分化。此外，在后期SMG導(dǎo)致發(fā)生腫瘤的特異性基因上調(diào)。
結(jié)論：我們的數(shù)據(jù)顯示SMG抑制成骨細胞增殖和分化，但促進脂肪形成。 SMG還選擇延長高致瘤性細胞在SMG下存活。
技術(shù)路線：

結(jié)果：
1.RNA-seq數(shù)據(jù)分析
首先，通過成對比較分別從誘導(dǎo)第0天（d0），第2天（NG2，SMG2），第7天（NG7，SMG7）和第14天（NG14，SMG14）的細胞獲得差異表達的基因（DEG）。DEG的類型和數(shù)量隨誘導(dǎo)時間而變化。

圖1 第2,7和14天的DEG和DEG的聚集。（A）DEG的維恩圖比較d0與NG2，NG2與NG7，NG7與NG14，以及d0與NG14和DEG的維恩圖比較d0與SMG2，SMG2與SMG7，SMG7與SMG14和d0與SMG14的比較。（B）NG2與SMG2，NG7與SMG7和NG14與SMG14的DEG。紅色，綠色和藍色點分別代表上調(diào)，下調(diào)和不顯著的基因。（C）熱圖顯示mRNA的轉(zhuǎn)化表達值的K均值聚類。黃色表示較高的表達，藍色表示較低的表達。（D）折線圖表示NG和SMG組中對應(yīng)于熱圖的八個簇中的基因的表達模式。前四個集群在NG組中，后四個集群在SMG組中。 DEGs，差異表達的基因; NG，正常地面條件; SMG，模擬微重力; d0，細胞誘導(dǎo)0天; NG2，細胞在正常地面條件下誘導(dǎo)2天; SMG2，細胞在模擬微重力條件下誘導(dǎo)2 d; NG7，細胞在正常地面條件下誘導(dǎo)7天; SMG7，細胞在模擬微重力條件下誘導(dǎo)7 d; NG14，細胞在正常地面條件下誘導(dǎo)14 d; SMG14，細胞在模擬微重力下誘導(dǎo)14天。     

2.GO/KEGG富集分析      
首先選擇了誘導(dǎo)第二天的來分析成骨早期差異表達。為了便于分析，選擇了三種本體（生物過程，細胞成分和分子功能）中10種最富集的GO條目。GO分析表明，大多數(shù)富集的DEG與三種本體的細胞周期和細胞分裂有關(guān)。三種本體中最富富集的GO條目分析，大多數(shù)基因都下調(diào)。KEGG分析表明，當(dāng)細胞被誘導(dǎo)兩天時，這些基因參與各種代謝途徑。此外還發(fā)現(xiàn)在分子功能中存在兩個GO條目與微管蛋白和細胞骨架相關(guān)。

圖2. GO分析三種本體中的DEGs和NG2與SMG2樣品中DEGs的途徑分析。（A）紅色，藍色和綠色分別代表生物過程，細胞成分和分子功能。（B）上調(diào)和下調(diào)基因分別從左到右富集三種本體，生物過程，分子功能和細胞成分。紅色代表上調(diào)節(jié)基因，綠色代表下調(diào)基因。（C）點的大小代表DEG的數(shù)量。 富含因子是指該途徑中富含的DEG與該途徑中所有注釋基因之間的比率。大的富集因子表示高度富集。q值越低，DEG的富集越顯著。GO，基因本體論; DEGs，差異表達的基因; NG2，細胞在正常地面條件下誘導(dǎo)2天; SMG2，細胞在模擬微重力下誘導(dǎo)2天。

緊接著為了驗證該結(jié)果，進行細胞增殖，細胞周期測定和肌動蛋白細胞骨架的免疫熒光以確定微重力的影響。在成骨誘導(dǎo)的0,12,24和48小時檢測細胞增殖，NG下比SMG細胞的增殖率更高。

圖3. 在NG和SMG下誘導(dǎo)0,12,24和48小時的hBMSC的細胞增殖和細胞周期分析。（A）在0,12,24和48小時的細胞增殖測定。實線表示在正常地面條件（NG）下誘導(dǎo)的細胞，虛線表示在模擬微重力（SMG）下誘導(dǎo)的細胞（n = 3）。 （B）在NG和SMG（n = 3）下誘導(dǎo)12,24和48小時的細胞G0 / G1，S和G2 / M期的百分比，以及G0 / G1，S和G2 /中細胞的百分比 在PI染色后通過流式細胞術(shù)確定M期（n = 3）。 黑色代表在NG條件下誘導(dǎo)的細胞，灰色代表在SMG條件下誘導(dǎo)的細胞。 * P <0.05，** P <0.01。hBMSCs，人骨髓間充質(zhì)干細胞。

為了研究成骨的中期和后期，選擇第7天和第14天進行GO和KEGG分析。GO分析表明，大多數(shù)富集的DEG與多細胞生物體過程有關(guān)。在NG14與SMG14組中，多細胞生物體過程，受體結(jié)合和細胞外區(qū)域是所研究的三種本體中三種最富集的GO條目。對富集的前20個統(tǒng)計數(shù)途徑分析，觀察到富含這些途徑的基因與免疫應(yīng)答，腫瘤進展，增殖，分化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。

圖4. NG7與SMG7樣品中DEG的GO和途徑分析。 （A）對三種本體中DEG的GO分析。 紅色，藍色和綠色分別代表生物過程，細胞成分和分子功能。 （B）NG7與SMG7途徑富集的前20個統(tǒng)計數(shù)據(jù)。 點的大小代表DEG的數(shù)量。 大的富集因子表示高度富集。 q值越低，DEG的富集越顯著。 （C）前20個富集途徑的上調(diào)和下調(diào)基因。 紅色表示上調(diào)基因，綠色表示下調(diào)基因。 GO，基因本體論; DEGs，差異表達的基因; NG7，細胞在正常地面條件下誘導(dǎo)7天; SMG7，細胞在模擬微重力下誘導(dǎo)7天

圖5. NG14與SMG14樣品中DEGs的GO和途徑分析。（A）對三種本體中DEG的GO分析。 紅色，藍色和綠色分別代表生物過程，細胞成分和分子功能。（B）NG14與SMG14途徑富集的前20個統(tǒng)計數(shù)據(jù)。點的大小代表DEG的數(shù)量。紅色表示較小的q值，藍色表示較大的q值。 較小的q值表示更顯著的富集。GO，基因本體論; DEGs，差異表達的基因; NG14，細胞在正常地面條件下誘導(dǎo)14 d; SMG14，細胞在模擬微重力下誘導(dǎo)14天。

結(jié)論：SMG在hBMSCs成骨早期抑制細胞增殖，而在中期，它抑制向成骨細胞的分化并促進脂肪生成。