肝癌轉(zhuǎn)移的引路人——lncRNA AY

  關(guān)于lncRNA與癌癥之間的研究是近年來的熱點，對于常見的癌癥如肝癌、胃癌等，研究者們投入了大量的時間和精力，研究其生長、轉(zhuǎn)移，侵襲的機制，以期找到治愈它們的有效辦法。今天小編就給大家?guī)砹私衲耆?，Dr. Liang Yang等人在雜志《Theranostics》上發(fā)表的題為“LncRNA AY promotes hepatocellular carcinoma metastasis by stimulating ITGAV transcription”的一篇文章，IF=8.063。 文章介紹了作者如何一步步證明lncRNA AY通過誘導(dǎo)ITGAV轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)修飾作為先導(dǎo)因子促進HCC轉(zhuǎn)移的，同時指出lncRNA AY是HCC患者轉(zhuǎn)移或預(yù)后不良的潛在分子標(biāo)志，這對HCC的治療有著重要的臨床意義。
實驗結(jié)果：
1.LncRNA AY927503在HCC細(xì)胞中高表達(dá)     
  研究者使用ArrayStar lncRNA芯片V2.0比較硫脂處理的HCC細(xì)胞和對照細(xì)胞的lncRNA圖譜，觀察到了一組全面的差異表達(dá)的lncRNA。
  在53對肝癌和鄰近的非腫瘤(NT)標(biāo)本隊列中，肝癌組織的AY表達(dá)明顯高于癌旁NT組織(P<0.001，圖1A，a&b)。在另一組80例HCC患者中，原位雜交分析顯示HCC組織中每個細(xì)胞的AY信號明顯高于鄰近NT組織(P<0.01，圖1B，a)。與T1和T2期患者相比，T3和T4期HCC患者的AY信號增加(P<0.05，圖1B，b)。隨訪患者(n=64)的生存分析顯示，低AY表達(dá)的患者比高AY表達(dá)的患者存活時間長(P=0.034，圖1B，c&d)。腫瘤大小(>3 cm)的患者AY水平高于小腫瘤患者(P<0.05，圖1B，e)。有血管腫瘤栓阻的患者AY水平高于無腫瘤栓阻的患者(P<0.05，圖1B，f)。分析來自腫瘤基因組圖譜(TCGA)肝癌數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)可以得出，肝癌組織與其配對NT組織相比，AY表達(dá)升高(P<0.001，N=248，圖1C，a)。Kaplan-Meier生存分析顯示，高AY水平與肝癌患者的總生存率差密切相關(guān)(N=180，P=0.0014，圖1C，b)。AY在乳腺(N=837)、腎臟(N=448)、肺(N=488)和肝組織中廣泛表達(dá)，AY在腫瘤中的表達(dá)高于正常組織(圖1D)。AY在MHCC97H(高轉(zhuǎn)移潛能)HCC細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于MHCC97L(低轉(zhuǎn)移潛能)HCC細(xì)胞(P<0.05，圖1E，a)。



2.AY促進ITGAV表達(dá)     
  已證明硫脂通過整合素αVβ3上調(diào)ITGAV促進肝癌的轉(zhuǎn)移。分析7種肝癌細(xì)胞株和人肝細(xì)胞LO2細(xì)胞株中AY和ITGAV的表達(dá)水平。AY在Hep3B、HepG2、LM3、SMMC-7721、Huh7、LO2、BEL-7404和SK-Hep1細(xì)胞中的表達(dá)譜與ITGAV相似，可發(fā)現(xiàn)AY和ITGAV表達(dá)水平之間存在密切的正相關(guān)(皮爾遜相關(guān)系數(shù)r=0.8729，圖1E，b-d)。分析53例HCC患者組織標(biāo)本中AY和ITGAV mRNA的表達(dá)水平，53例HCC組織中有36例顯示AY水平明顯高于鄰近NT組織(P<0.01，圖1A，c)。在36個樣本中，33個也表達(dá)高水平的ITGAV。17個HCC樣本中有5個AY水平低于鄰近NT組織，ITGAV水平也較低(圖1A，d)。皮爾遜卡方(χ2)檢驗結(jié)果顯示，AY和ITGAVmRNA表達(dá)水平之間存在顯著相關(guān)性(P<0.0 5)。TCGA數(shù)據(jù)分析顯示AY和ITGAV表達(dá)水平密切相關(guān)(N=122，P<0.0001，圖1C，c)。在過度表達(dá)AY的HCC細(xì)胞中，ITGAV mRNA水平幾乎增加了兩倍，但敲除AY使ITGAV mRNA水平急劇降低(圖2A)。在過度表達(dá)AY的HCC細(xì)胞中，ITGAV蛋白水平也增強，并且與對照細(xì)胞相比，AY敲除細(xì)胞中的ITGAV蛋白水平顯著降低(圖2B)。免疫熒光分析顯示，在過度表達(dá)AY的肝癌細(xì)胞中，ITGAV和整合素αVβ3在細(xì)胞表面的表達(dá)明顯增加，而在AY敲除細(xì)胞中則下降(圖2C)。


3.AY促進肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)行為     
  血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素，與整合素αVβ3相關(guān)，研究者進行管腔形成實驗來研究AY在血管生成中的作用。過表達(dá)AY的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)顯示明顯多于模擬細(xì)胞的分支點(血管生成的指標(biāo))(P<0.01，圖3A)。敲除ITGAV可消除AY在HUVECs中的血管生成作用且使分支點減少到低于對照組的數(shù)目。ITGAV的過表達(dá)能恢復(fù)HUVECs的分枝能力。在轉(zhuǎn)染AY的細(xì)胞中形成的菌落數(shù)量明顯多于模擬細(xì)胞。與擾亂對照相比，沉默AY的細(xì)胞中的菌落數(shù)量明顯減少(圖3B，a)。AY的過表達(dá)顯著增加了細(xì)胞活力(圖3B，b)，敲除ITGAV消除這種AY效應(yīng)。在Hep3B細(xì)胞中，敲除AY顯著降低了細(xì)胞活力，轉(zhuǎn)染ITGAV或AY構(gòu)建挽救了細(xì)胞活力(圖3B，b)。
  EMT是HCC中使腫瘤細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的重要過程。AY顯著降低E-cadherin的表達(dá)水平，并提高N-cadherin、ZEB1或Twist的水平(圖3C，a&b)。這些AY效應(yīng)被ITGAV敲低所消除。相反，敲除AY促進E-cadherin，但抑制N-cadherin，vientin，ZEB1和Twist表達(dá)，ITGAV過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)(圖3C，a&b)。AY的過表達(dá)增強了干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4和SOX2的表達(dá)，這種效應(yīng)被ITGAV敲低所消除(圖3d，a&b)。AY沉默則情況相反。2μM 5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的細(xì)胞與對照細(xì)胞相比，AY表達(dá)明顯降低(P<0.0 1，圖3E，a&b)；與模擬組相比，2μM 5-FU處理的細(xì)胞活力因AY的過表達(dá)而顯著增強，因ITGAV的沉默而降低(圖3e，c)。AY敲除顯著抑制了5-FU處理的Hep3B細(xì)胞的細(xì)胞活力，但AY或ITGAV的過表達(dá)在48小時后完全恢復(fù)了細(xì)胞活力(圖3E，d)。過量表達(dá)AY的HepG2細(xì)胞的5-FU半數(shù)抑制濃度(IC50)明顯高于對照細(xì)胞。 敲除AY可顯著降低5-FU在Hep3B細(xì)胞中的IC50(圖3E，e&f)。





4.AY促進HCC轉(zhuǎn)移     
  利用腫瘤異種移植，研究lncRNA AY在體內(nèi)對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響。基于AY和ITGAV水平，選擇穩(wěn)定的AY過表達(dá)(AY4)和對照(M6)細(xì)胞進行腫瘤異種移植實驗(圖4A)。將AY4或M6細(xì)胞(5×106細(xì)胞)皮下注射給4周齡雌性BALB/c裸鼠(n=10/組)，觀察腫瘤大小，發(fā)現(xiàn)AY組的腫瘤明顯大于對照組(圖4B)。AY組的AY和ITGAVmRNA水平高于對照組，并且ITGAV和整合素αVβ3(圖4C，a和b)的染色比對照組強。AY組腫瘤組織陽性CD31(血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物)染色高于對照組(圖4D，a)。在AY組的Matrigel-plug中也觀察到比對照組更多的CD31陽性細(xì)胞(圖4D，b)。AY組肝和肺轉(zhuǎn)移灶也明顯多于對照組(圖4E)。在AY組肝轉(zhuǎn)移組織中ITGAV染色比對照組更強烈(圖4F)。


5.AY增強ITGAV基因轉(zhuǎn)錄     
  在HCC細(xì)胞中進行原位雜交分析，觀察到AY定位在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中(圖5A，a)。通過RNA純化(Chirp)分離染色質(zhì)的實驗，以使用生物素化的AY來拉低超聲剪切的基因組DNA，發(fā)現(xiàn)ITGAV啟動子是AY復(fù)合體的一部分(圖5B)，這表明AY與ITGAV啟動子相互作用。使用全長ITGAV啟動子(-1295至+207)進行熒光素酶報告分析，以研究AY對ITGAV啟動子活性的影響(圖5A，b)。AY過表達(dá)顯著刺激了SMMC7721(P<0.001)，HEK293T(P<0.001)和HeLa(P<0.001)細(xì)胞的ITGAV啟動子活性(圖5A，c)，這些細(xì)胞中的AY敲除顯著降低了ITGAV啟動子的活性(圖5A，d)。全長AY不增強酪氨酸羥化酶(TH)或pGL3啟動子活性(圖5C，d)，這表明AY特異性調(diào)節(jié)ITGAV啟動子活性。
  AY結(jié)構(gòu)域缺失實驗(圖5D)發(fā)現(xiàn)突變體5(1-671)和4(1-522)顯示增強的ITGAV啟動子活性，類似于全長AY(圖5C，a&b)，但突變體2(1?371)和1(1?298)在HEK293T和SMC-7721細(xì)胞中均未顯示出增強的ITGAV啟動子活性。突變體3(1?401)表現(xiàn)出部分刺激效應(yīng)。這些結(jié)果表明，AY的371-522結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏Y對ITGAV啟動子活性的調(diào)控具有重要作用。突變體AYΔ371-522缺乏371-522結(jié)構(gòu)域，沒有顯示AY誘導(dǎo)的ITGAV啟動子活性(圖5C，c)。單獨過表達(dá)AY的371-522片段或AY?371-522 序列均不能刺激 ITGAV啟動子的活性和轉(zhuǎn)錄。只有當(dāng)全長AY過表達(dá)時，才在BEL-7404和SMMC-7721細(xì)胞中檢測到ITGAV的表達(dá)(圖5E，a&b)。ITGAV蛋白表達(dá)也觀察到類似的結(jié)果(圖5E，c)。此外，無論是AY?371-522還是AY371-522都不能單獨促進傷口閉合率(圖5E，d)。



6.AY與鏈接蛋白H1FX相互作用      
  RNA免疫沉淀(RIP)和RNA下拉分析顯示AY與已知對ITGAV表達(dá)重要的因素(8，9，21)之間沒有顯著的相互作用。在這兩種方法中，沒有發(fā)現(xiàn)AY與ZNF282的相互作用(數(shù)據(jù)未顯示)。通過質(zhì)譜和高通量蛋白質(zhì)芯片實驗，篩選與AY相關(guān)的蛋白質(zhì)。通過質(zhì)譜和蛋白芯片分析鑒定組蛋白1FX(H1FX)和Ig kappa鏈C區(qū)(IGKC)。IGKC被排除在進一步的分析之外。RNA下拉試驗顯示AY和H1FX之間存在直接相互作用(圖6A，a)。在由奇數(shù)或偶數(shù)AY探針池拉下的復(fù)合體中也觀察到H1FX(圖5B)。在其他六個組蛋白H1變異體中，H1.2、H1.3和H1.4與AY在復(fù)合物中沉淀，但H1.0、H1.1和H1.5沒有(圖6A，a)。H1FX、H1.2、H1.3和H1.4也與AY371?522結(jié)構(gòu)域相互作用(圖6A，b)。在AY缺失突變體AY?371?522中，共沉淀復(fù)合體中H1FX水平明顯降低，但與包含全長AY的沉淀相比，H1.2，H1.3或H1.4水平保持不變。結(jié)果表明AY(371?522)的中心結(jié)構(gòu)域與H1FX相互作用。


7.AY與H1FX結(jié)合誘導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)     
  使用五對引物通過染色質(zhì)免疫沉淀分析測試了ITGAV啟動子的H1FX占有率(圖6B，a)。H1FX不僅在-1241到-677之間占據(jù)了ITGAV啟動子區(qū)域(圖6B，b)，而且在內(nèi)含子1和外顯子1和2上也被觀察到。
  RNA聚合酶II(Pol 11)占據(jù)了內(nèi)含子1和上游區(qū)域從-894到-492(圖6B，d)。Ay過表達(dá)顯著增加了pol II在上游區(qū)域的占有率，但內(nèi)含子1和上游區(qū)域從-894到-492的H1FX占有率顯著降低(圖6B，c&e)。啟動子上H3K27me3(一種含有三甲基化賴氨酸27殘基的組蛋白H3)占有率降低(圖6C)。AY顯著增強了ITGAV啟動子上H3K4me3和acH3K9/14的占有率(圖6C)。H1FX沉默消除了AY過表達(dá)對ITGAV啟動子的刺激(圖6D，a)。H1.2，H1.3或H1.4的沉默對ITGAV的表達(dá)沒有任何影響，由于AY過表達(dá)，它們在ITGAV啟動子上的占有率沒有改變(圖6D，a&b)。這些結(jié)果表明AY與H1FX相互作用誘導(dǎo)ITGAV啟動子上的核心組蛋白修飾。
8.AY誘導(dǎo)的核心組蛋白修飾排斥H1FX結(jié)合
  連接組蛋白與DNA/核小體的結(jié)合是由組蛋白伴侶蛋白實現(xiàn)的。通過質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)組蛋白1伴侶核仁蛋白(NCL)是AY復(fù)合物的一部分。核糖核酸下拉試驗顯示NCL與全長AY和突變的AY(AY371-522，AY?371-522)相互作用(圖6A)。AY的過表達(dá)顯著降低了ITGAV啟動子上NCL的富集(從-894到-492)(圖6D，b)。NCL的沉默也減弱了AY對ITGAV轉(zhuǎn)錄的刺激作用(圖6D，a)。AY的異位表達(dá)顯著增強了組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶PCAF(acH3K9/14的組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶)的占有率，但減少了組蛋白去乙酰化酶SIRT1在ITGAV啟動子區(qū)域-894到-677的富集(圖6e)。來自芯片序列的數(shù)據(jù)確實表明SIRT1和PCAF被結(jié)合在ITGAV位點上(圖6F)。結(jié)果表明，AY招募組蛋白修飾酶并誘導(dǎo)區(qū)域組蛋白修飾，從而排斥NCL/H1FX結(jié)合并激活I(lǐng)TGAV啟動子。