揭秘一種新的參與白血病調(diào)控的LncRNA

      LncRNAs是一類長度大于200 nt不編碼蛋白質的核苷酸，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多種人類疾病中均有異常表達，包括癌癥。9號染色體和22號染色體相互易位產(chǎn)生嵌合的Bcr-Abl癌基因，該基因與幾種血液病有關。然而，LncRNAs的異常表達與Bcr-Abl介導的白血病之間的相關性功能仍不清楚。
      今年，Xuefei Wang等人在Mol Cancer發(fā)表一篇 “Novel lncRNA-IUR suppresses Bcr-Abl-induced tumorigenesis through regulation of STAT5-CD71 pathway”的SCI文章，該研究旨在綜合評價經(jīng)伊馬替尼 （Imatinib）處理的人K562白血病細胞中LncRNAs的表達情況。
技術路線：

一、鑒定伊馬替尼處理白血病細胞后上調(diào)的lncRNAs

利用lncRNA cDNA芯片分析在K562細胞中表達的LncRNAs，圖A表示伊馬替尼處理或不處理組，差異表達的LncRNAs聚類分析，987個上調(diào)LncRNA，1479個下調(diào)LncRNA。圖B表示伊馬替尼處理后顯著上調(diào)的一個LncRNA 家族(Imatinib -upregated LncRNA，簡稱為lncRNA-IUR)，該LncRNA 家族有多個轉錄本，人來源的有8個轉錄本，鼠來源的有5個轉錄本。圖C表示qPCR證明在K562白血病細胞中伊馬替尼處理組相對于對照組lncRNA-IUR表達上調(diào)，lncRNA-IUR-5，6，8的表達具有顯著性差異。圖D表示qPCR證明在v-Abl轉化的小鼠NS2細胞株中伊馬替尼處理組相對于對照組lncRNA-IUR表達上調(diào)，lncRNA-IUR-4，5，6，8觀察到類似的的表達具有顯著性差異，與圖C結果一致。圖E和F表示從蛋白水平與RNA水平，BCR-Abl陽性患者外周血淋巴細胞lncRNA-IUR的表達顯著低于正常人外周血淋巴細胞。上述結果表明，在Abl轉化的白血病細胞中l(wèi)ncRNA-IUR的表達受到抑制，然而伊馬替尼可誘導lncRNA-IUR表達.
此外，通過軟件預測和實驗分析lncRNA-IUR的編碼潛力.進一步運用the Open Reading Frame (ORF) Finder，發(fā)現(xiàn)lncRNA-IUR每個轉錄本的ORF總長度小于300 bp。在UniProtKB/ swissprot(Swissprot)數(shù)據(jù)庫中也沒有預測到lncRNA-IUR的匹配肽。此外，運用Coding Potential Calculator (CPC)軟件評估lncRNA-IUR家族是否具備編碼能力，圖G表示每個轉錄本的CPC評分為負，表明lncRNA-IUR家族“非編碼”。圖I表示在體外翻譯實驗中，我們能夠觀察對照基因KU70的蛋白帶(約70kD)，但未能檢測lncRNA-IUR-5、6或8的任何蛋白條帶。為了進一步證明lncRNA-IUR沒有編碼能力，通過RACE試驗鑒定了一段全長的lncRNA-IUR-5(2342 nt)。
二、lncRNA-IUR影響abl轉化細胞存活及體內(nèi)腫瘤生長

我們研究了在異種移植小鼠模型中，為了證明lncRNA-IUR是否對細胞存活和腫瘤形成有影響，運用shRNAs生成了lncRNA-IUR (sh- IUR -5，-6和-8)的K 562細胞株或熒光素以及顯示熒光的對照細胞，圖A表示lncRNA-IUR (sh- IUR -5，-6和-8)的K 562細胞lncRNA-IUR的表達相對于對照組明顯降低，表明敲減成功。圖B表示Imatinib濃度越高，K562細胞的生存率降低，lncRNA-IUR抑制細胞生存。圖C和D表示采用異種移植小鼠模型，每只小鼠皮下接種表達shlncRNA-IUR的K562細胞，敲減lncRNA-IUR-5，6，8基因顯著促進腫瘤生長。在V-ABL-轉化的NS2細胞系，并使用SH- IUR -M45678敲減小鼠lncRNA-IUR-5，圖F表示在NS2細胞中，敲減shlncRNA-IUR促進了細胞的存活。此外，圖G表示sh- IUR--m45678的NS2細胞所形成的腫瘤比對照組大得多。實時定量PCR也證實了sh- IUR--m45678組相對于對照組 INcRNA-IUR在腫瘤中的表達下調(diào)。這些結果表明，無論在K562細胞還是在異種移植小鼠模型中，敲減INcRNA-IUR促進Abl轉化的白血病細胞的存活和腫瘤的生長。

與上述結果一致，只是一種運用敲減INcRNA-IUR的方法，一種運用過表達INcRNA-IUR的方法，在異種移植小鼠模型中，過表達INcRNA-IUR抑制Abl轉化的白血病細胞的存活和腫瘤的生長。
三、在體內(nèi)敲減鼠LncRNA-IUR促進ABL介導的骨髓細胞轉化和白血病細胞的生長

 A、LncRNA-IUR- KD轉基因小鼠及WT小鼠的照片。B、RT-PCR檢測LncRNA-IUR- KD轉基因及WT小鼠中肺、脾、肝、胸腺和骨髓器官LncRNA-IUR -M5的表達.C、WT和KD小鼠中Bcr-Abl轉化BMC細胞的存活克隆數(shù)，KD小鼠的轉化效率顯著高于野生型小鼠。D、通過注射表達sh- IUR -m45678，sh-luc的GFP陽性NS2細胞來建立白血病移植小鼠模型，三組分別標記為SH-Iur-M45678組、SH-Luc組和陰性對照組。E、白血病移植后8天后，生物發(fā)光成像顯示穩(wěn)定表SH-Iur-M45678或SH-Luc的GFP陽性NS2細胞在WT小鼠體內(nèi)分布。F、流式細胞實驗檢測小鼠白血病移植后第6與第9天外周血單個核細胞的變化。這些結果表示敲減鼠LncRNA-IUR促進體內(nèi)ABL介導的骨髓細胞(BMC)轉化和NS2細胞的生長。
四、轉基因小鼠沉默LncRNA-Iur為Abl介導的白血病的發(fā)生發(fā)展提供了理想的微環(huán)境。

A、建立KD和WT小鼠白血病移植模型， LncRNA-Iur-KD與WT小鼠在輻射后通過尾部靜脈注入GFP陽性NS2細胞或等體積的PBS，實驗組標記為NS2KD和NS2WT，對照組為PBS-KD和PBS-WT。 B、顯示NS2-KD和NS2-WT小鼠在體內(nèi)白血病移植后的第8天的代表性照片。C和D分別表示有缺陷的老鼠的體重(C)和存活率(D)，每組小鼠8-10只。對小鼠進行為期15天的監(jiān)測。E、生物發(fā)光成像實驗觀察GFP陽性NS2細胞在小鼠體內(nèi)的分布情況.F、流式細胞實驗檢測小鼠外周血單個核細胞中GFP陽性NS2細胞的百分率。三個獨立實驗，選擇代表性的圖像。G、HE染色小鼠脾臟。
五、LncRNA-IUR-5負調(diào)節(jié)STAT5介導的CD71表達

A、LncRNA-IUR-5敲除k562細胞系和對照細胞的轉錄組RNA測序分析。箭頭表示CD71蛋白的三種亞型。B、 Western blot分析LncRNA-IUR-5基因敲除或過表達K562細胞株CD71 蛋白的表達水平。C-E 、Westernblotting證明分別用伊馬替尼(C)、STAT5-In-1(50μM，6h)（D）或sh-STAT 5(E)敲除STAT 5來處理細胞，CD71 、P-STAT 5與STAT 5蛋白的表達水平。F、Western blot和RT-PCR檢測CD71 、P-STAT 5與STAT 5蛋白和LncRNA-IUR-5的表達水平。G、從穩(wěn)定表達LncRNA-IUR -S1、Iur-5或Iur-5的K 562細胞株中提取與LncRNA-IUR-5結合的蛋白。H、通過RIP驗證LncRNA-IUR-5與STAT5的相互作用。lncRNA-BGL3和gapdh2為陰性對照。I和J、qPCR檢測在STAT5-IN-1處理后或敲減K562細胞中l(wèi)ncRNA-IUR的表達。