LncRNA調(diào)控糖尿病心肌病的心肌細(xì)胞自噬

糖尿病性心肌病是嚴(yán)重威脅糖尿病患者生命的一類的心肌疾病，如何預(yù)防和有效救治這一疾病，對挽救糖尿病患者的生命有重大意義。近期，一篇名為“LncRNA DCRF regulates cardiomyocyte autophagy by targeting miR-551b-5p in diabetic cardiomyopathy”的文章，在Theranostics上發(fā)表，文章中報道了關(guān)于DCM的最新研究成果。研究者們通過一系列的實驗，研究了高糖環(huán)境下DCRF/miR-551b-5p/PCDH17通路如何調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬，是功課糖尿病心肌病這一疾病的新突破口。
摘要：
背景：研究者們建立了糖尿病心肌病(DCM)大鼠模型，并報告了長非編碼RNA DCRF的顯著上調(diào)。本研究旨在探討DCRF在DCM發(fā)生發(fā)展中的分子機制。
方法：采用實時定量PCR和RNA熒光原位雜交技術(shù)檢測DCRF在心肌細(xì)胞中的表達(dá)模式。用組織學(xué)和超聲心動圖分析評估DCRF敲低對糖尿病大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響。mRFP-GFP-LC3熒光顯微鏡、透射電子顯微鏡和Western blotting檢測心肌細(xì)胞自噬。通過RNA免疫沉淀和熒光素酶報告實驗來闡明DCRF/miR-551b-5p/PCDH17通路在心肌細(xì)胞自噬中的調(diào)節(jié)作用。
結(jié)果：研究結(jié)果表明，DCRF敲低可減少糖尿病大鼠心肌細(xì)胞自噬，減輕心肌纖維化，改善心功能。高糖增加心肌細(xì)胞DCRF表達(dá)并誘導(dǎo)自噬。RNA免疫沉淀和熒光素酶報告分析表明，DCRF以AGO2依賴的方式被miR-551b-5p靶向，PCDH17是miR-551b-5p的直接靶標(biāo)。強迫表達(dá)DCRF可減弱miR-551b-5p對PCDH17的抑制作用。此外，DCRF敲低降低PCDH17的表達(dá)并抑制高糖處理的心肌細(xì)胞的自噬。
結(jié)論：研究表明，DCRF可以作為競爭的內(nèi)源性RNA，通過海綿miR-551b-5p增加PCDH17的表達(dá)，從而促進(jìn)DCM中心肌細(xì)胞自噬的增加。
技術(shù)路線：

結(jié)果：
1. DCRF在心肌細(xì)胞中的表達(dá)模式
      DCRF位于大鼠基因組RNOR_6中的Chr2：228036171-228036880，其序列如表1所示。實時PCR和FISH分析表明，DCRF主要表達(dá)在心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖1A和B)。此外，DCRF在糖尿病大鼠心肌和高糖處理的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)(圖1C和D)。
表 1. DCRF 序列

圖1. DCRF在心肌細(xì)胞中的表達(dá)模式。 (A) 實時熒光定量PCR檢測DCRF、GAPDH(細(xì)胞質(zhì)對照)和U6(細(xì)胞核對照)在心肌細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)部分的表達(dá)。(B) 用Cy3標(biāo)記的正義(Control)和反義探針(DCRF)進(jìn)行RNA-FISH檢測DCRF在心肌細(xì)胞中的表達(dá)。(C, D) 實時定量PCR檢測DCM大鼠心肌組織和高糖(HG，30 mmol/L)處理的心肌細(xì)胞中DCRF的表達(dá)。 (n = 5, *P < 0.05)。
2. DCRF敲低改善糖尿病大鼠組織學(xué)異常
      心肌組織HE染色和Masson‘s三色染色，測定CsA和CVF。HE染色顯示糖尿病心肌的典型組織學(xué)變化，包括心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維斷裂，細(xì)胞間隙增加，而DCRF敲低與較少的組織學(xué)異常相關(guān)(圖2A)。此外，Masson染色表明DCRF的表達(dá)減少可以減輕糖尿病大鼠的心肌纖維化(圖2B)。此外，CSA和CVF在DM組明顯增加，DM+DCRF-shRNA組降低(圖2C和D)。

圖2. DCRF敲低可改善糖尿病大鼠的組織學(xué)異常。 (A, C) 用 hematoxylin-eosin staining染色心肌組織，測量心肌細(xì)胞橫截面積。 (B, D) 用Masson‘s三色染色法對心肌組織進(jìn)行染色，計算膠原體積分?jǐn)?shù)。 (n = 5, *P < 0.05)。
3. DCRF敲低改善糖尿病大鼠心功能
      經(jīng)胸超聲心動圖評價DCRF敲低對心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響。如圖3A所示，DCRF在糖尿病心肌中表達(dá)上調(diào)，并在DCRF-shRNA轉(zhuǎn)染后下調(diào)。超聲心動圖測量顯示DM組LVESD和LVEDD增加，DM+DCRF-shRNA組LVESD和LVEDD降低(圖3B和C)。此外，糖尿病大鼠的LVFS和LVEF降低，而DCRF敲低可改善左心室功能(圖3D)。

圖3. DCRF敲低可改善糖尿病大鼠的心功能。 (A) 實時熒光定量PCR檢測心肌組織中DCRF的表達(dá)(n = 5, *P < 0.05)。 (B-D) 超聲心動圖評價心臟結(jié)構(gòu)和功能(n = 5, *P < 0.05)。LVESD=左心室收縮末期內(nèi)徑；LVEDD=左心室舒張末期內(nèi)徑；LVFS=左心室短軸縮短率；LVEF=左心室射血分?jǐn)?shù)。
4.DCRF參與心肌細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)
      透射電鏡和mRFP-GFP-LC3熒光顯微鏡檢測心肌細(xì)胞自噬。如圖4A所示，自噬在糖尿病心肌中升高，而DCRF敲低顯著減少了自噬小體的數(shù)量。此外，高糖處理與心肌細(xì)胞自噬增加有關(guān)，而DCRF-siRNA轉(zhuǎn)染可以減弱高糖誘導(dǎo)的自噬(圖4B)。

圖4. DCRF參與了心肌細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)。 (A) 糖尿病大鼠心肌內(nèi)注射含有DCRF-shRNA或scrambled-shRNA的腺相關(guān)病毒。12周后，用透射電鏡檢測心肌中的自噬小體。(B) 將含有DCRF-siRNA或scrambled-siRNA的腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，然后暴露于高糖(HG，30 mmol/L)。48小時后，采用串聯(lián)mRFP-GFP-LC3熒光顯微鏡觀察心肌細(xì)胞自噬情況。
5. miR-551b-5p以AGO2依賴的方式靶向DCRF
      生物信息學(xué)分析表明，DCRF序列包含miR-551b-5p的假定結(jié)合位點(圖5A)。miR-551b-5p mimics轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中miR-551b-5p的表達(dá)升高(圖5B)。將DCRF cDNA克隆到熒光素酶基因(Luc-DCRF-Wt)下游，用miR-551b-5pmimics轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。然后我們在DCRF中突變miR-551b-5p結(jié)合位點，產(chǎn)生Luc-DCRF-Mut。熒光素酶實驗表明miR-551b-5p轉(zhuǎn)染可抑制Luc-DCRF-Wt的活性，但不能抑制LUC-DCRF-MUT的活性(圖5C)。
      DCRF主要表達(dá)于心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。因此，我們推測DCRF可能通過起miRNA海綿的作用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。AGO2蛋白是RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體的核心成分。RIP分析顯示DCRF和miR-551b-5p在抗AGO2而不是抗IgG下拉的免疫沉淀中特別豐富(圖5D).

圖5. DCRF以AGO2依賴的方式被miR-551b-5p靶向。 (A) 生物信息學(xué)預(yù)測表明，DCRF序列含有miR-551b-5p的推測結(jié)合位點。(B) miR-551b-5pmimics轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后miR-551b-5p的表達(dá)增加(n = 3, *P < 0.05)。(C) 將DCRF cDNA克隆到熒光素酶基因(Luc-DCRF-Wt)下游，用miR-551b-5pmimics或?qū)φ展押塑账徂D(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞。將DCRF中的miR-551b-5p結(jié)合位點突變?yōu)閘uc-DCRF-Mut。轉(zhuǎn)染48小時后檢測熒光素酶活性(n = 3, *P < 0.05)。(D) RIP法驗證DCRF和miR-551b-5p是否與心肌細(xì)胞中的AGO2直接結(jié)合(n = 3, *P < 0.05)。
6. PCDH17是心肌細(xì)胞中miR-551b-5p的直接靶點
      在miR-551b-5p的潛在靶點中，我們對參與自噬調(diào)節(jié)的PCDH17感興趣(圖6A)。將PCDH17的3‘-UTR融合到熒光素酶的編碼區(qū)，用miR-551b-5pmimics轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞。結(jié)果表明PCDH17是miR-551b-5p的直接靶標(biāo)(圖6B)。此外，在miR-551b-5p antiagomir轉(zhuǎn)染后，PCDH17的表達(dá)增加，從而導(dǎo)致自噬增強，而PCDH17敲低可以減弱miR-551b-5p antagomir轉(zhuǎn)染后的自噬(圖6C和D)。
      為了確定DCRF是否競爭性地抑制miR-551b-5p與PCDH17的結(jié)合，我們在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行了熒光素酶報告試驗。結(jié)果表明，DCRF可抵消miR-551b-5p對PCDH17的抑制作用(圖6e)，提示DCRF可能通過海綿miR-551b-5p發(fā)揮競爭內(nèi)源性RNA(ceRNA)的作用，控制PCDH17的表達(dá)。

圖 6. PCDH17是心肌細(xì)胞miR-551b-5p的直接靶點。 (A) 利用miRBase預(yù)測PCDH17為miR-551b-5p的靶基因。(B) 用miR-551b-5p模擬物和pcDH17 3‘UTR(luc-PCDH17-Wt)或突變體(luc-PCDH17-Mut)的熒光素酶結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時后檢測熒光素酶活性(n = 3, *P < 0.05)。(C) 將miR-551b-5p antiagomir和/或PCDH17 siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞。Western blotting檢測PCDH17的表達(dá)(n = 3, *P < 0.05)。(D) 通過檢測LC3的表達(dá)來評估心肌細(xì)胞的自噬(n = 3, *P < 0.05)。(E) 用pcDH17 3‘UTR、miR-551b-5p mimic和pcDNA-DCRF的熒光素酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。熒光素酶測定確定DCRF是否競爭性地抑制miR-551b-5p與PCDH17的結(jié)合 (n = 3, *P < 0.05)。
7. 高糖通過調(diào)節(jié)DCRF/PCDH17軸促進(jìn)自噬
      轉(zhuǎn)染DCRF-siRNA和/或pc DNA-PCDH17后，將心肌細(xì)胞置于高糖環(huán)境中，Western blotting檢測LC3的表達(dá)。結(jié)果表明，高糖可增加PCDH17表達(dá)并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬，而DCRF敲低與PCDH17表達(dá)降低和心肌細(xì)胞自噬有關(guān)。此外，DCRF-siRNA和PC DNA-PCDH17共轉(zhuǎn)染促進(jìn)了高糖處理的心肌細(xì)胞的自噬(圖7A-C)。

圖 7. 高糖通過調(diào)節(jié)DCRF/PCDH17軸促進(jìn)自噬。 (A, B)  用含DCRF-siRNA或PCDH17的腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，然后置于高糖環(huán)境(30 mmol/L)48h。實時熒光定量PCR和Western blotting分析PCDH17的表達(dá)(n = 3, *P < 0.05)。 (C) 通過檢測LC3的表達(dá)來評估心肌細(xì)胞的自噬(n = 3, *P < 0.05)。
結(jié)論：
      研究顯示DCRF在糖尿病心肌中的表達(dá)增加。通過發(fā)揮ceRNA的作用，DCRF可以通過海綿miR-551b-5p上調(diào)PCDH17，從而激活心肌細(xì)胞自噬，從而促進(jìn)DCM的進(jìn)展。