lncRNA Gm10451在iPSC衍生的β樣細(xì)胞分化中掩藏的秘密

參考文獻(xiàn)：
Huang Yan., Xu Yang., Lu Yuhua., Zhu Shajun., Guo Yibing., Sun Cheng., Xu Lianchen., Chen Xiaolan., Zhao Yahong., Yu Bin., Yang Yumin., Wang Zhiwei., (2019). lncRNA Gm10451 regulates PTIP to facilitate iPSCs-derived β-like cell differentiation by targeting miR-338-3p as a ceRNA., Biomaterials, 216, 119266.  IF：10.273
導(dǎo)語(yǔ)：
      iPSC衍生的胰島素生成細(xì)胞移植是治療糖尿病比較有前景的一種策略。盡管在過去幾年中已經(jīng)有許多成熟的體外誘導(dǎo)葡萄糖反應(yīng)性β細(xì)胞的方案，但許多潛在的問題仍有待解決。作為一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，長(zhǎng)的非編碼RNA（lncRNA）參與了許多生物過程，包括維持全能性和干細(xì)胞分化。在這項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)了一種新的lncRNA Gm10451作為β樣細(xì)胞分化的功能調(diào)節(jié)因子。 Gm10451定位于細(xì)胞質(zhì)，通過靶向miR-338-3p作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）來調(diào)節(jié)組蛋白H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物PTIP以促進(jìn)胰島素+ / Nkx6.1 +β樣細(xì)胞分化。 miR-338-3p通過靶向PTIP抑制Nkx6.1 +早期β樣細(xì)胞分化。移植到鏈脲佐菌素（STZ）小鼠后，β樣細(xì)胞中Gm10451的缺失抑制了成熟β細(xì)胞的表達(dá)，例如胰島素，Nkx6.1和Mafa。雖然小鼠的高血糖癥仍未得到解決，但是該研究為生產(chǎn)更成熟和功能性的iPSC衍生的β樣細(xì)胞提供了有效的表觀遺傳靶標(biāo)。此外，作者推測(cè)，將來可用由人類干細(xì)胞、生物材料和表觀遺傳修飾產(chǎn)生的胰腺類器官作為新型糖尿病治療的手段。一、差異表達(dá)的lncRNA主要參與iPSC衍生的β樣細(xì)胞分化      使用3步方案，將小鼠GFP + -iPSC分化成β樣細(xì)胞（圖1A）。大約31.63±1.52％（n = 3）的晚期細(xì)胞共表達(dá)胰島素和Nkx6.1，兩者都是成熟β細(xì)胞的標(biāo)志物（圖1B）。雖然β樣細(xì)胞表達(dá)胰島素和成熟的β細(xì)胞標(biāo)志物，如Pdx1，Nkx6.1，Mafa，ISL和Glut2，但與成年小鼠胰島相比仍有明顯的差距（圖1C）。與成年小鼠胰島一樣，β樣細(xì)胞可響應(yīng)不同濃度的葡萄糖分泌胰島素（圖1D）。收集4天，14天，21天且時(shí)期處在圖1A中步驟3的樣品測(cè)序，得到302個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，2233個(gè)差異表達(dá)的mRNAs，并做聚類熱圖（圖1E）。得到了6個(gè)模式的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)的lncRNA的表達(dá)譜（圖1E）。作者發(fā)現(xiàn)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的22個(gè)上調(diào)的lncRNA和521個(gè)mRNA似乎是直接相關(guān)的。于是對(duì)這22個(gè)lncRNA做GO分析，結(jié)果顯示，共表達(dá)的lncRNA主要富集的生物過程包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控，細(xì)胞增殖，遷移和凋亡（圖1E）。

                                         圖1差異表達(dá)的lncRNA主要參與iPSC衍生的β樣細(xì)胞分化
二、敲除lncRNA Gm10451抑制iPSC-derivedβ-like細(xì)胞分化
      qRT-PCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，如圖2所示，lncRNAs Gm10451在分化的早期和中期顯示出明顯的上調(diào)表達(dá)，選其用于進(jìn)一步的功能研究（圖2A）。為了確定Gm10451是否是β樣細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，作者構(gòu)建了siRNA的Gm10451， RT-PCR證實(shí)siRNA在早期細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了約75％的Gm10451敲低（圖2B）。在細(xì)胞培養(yǎng)期間，每7天用siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞以確保Gm10451表達(dá)處于相對(duì)低的水平，并通過qRT-PCR檢測(cè)表達(dá)水平（圖2B）。胰腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞的所有必需轉(zhuǎn)錄因子（TF），例如Pdx1，Nkx6.1，Ngn3，Sox9，Pax4 / 6和Gata4 / 6，在Gm10451沉默的細(xì)胞中下調(diào)（圖2C）。通過免疫熒光染色，我們觀察到在早期分化（步驟3的第6天）中Pdx1，Nkx6.1和Sox9陽(yáng)性細(xì)胞減少（圖2D）。該數(shù)據(jù)表明， Gm10451可能在β樣細(xì)胞的早期分化調(diào)節(jié)胰腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞形成中涉及的關(guān)鍵TF的表達(dá)中起著重要作用。

                                        圖2敲除lncRNA Gm10451抑制iPSC-derivedβ-like細(xì)胞分化
      然后，使用選擇性分化培養(yǎng)基培養(yǎng)Gm10451敲除的細(xì)胞15天，收集用于進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)。Gm10451對(duì)胰島素+ / Nkx6.1 +β樣細(xì)胞群減少的干擾從37.2±1.21％增加到18.6±1.51％（n = 3）（圖2E）。免疫熒光染色也有相似的結(jié)果， NC細(xì)胞胰島素+和共表達(dá)Nkx6.1和Mafa的水平比siRNA組更高（圖2F）。此外，胰島功能標(biāo)志物mRNA的表達(dá)顯著下降，包括胰島素，Glut2，ISL，GCG和SST。并且與對(duì)照（NC）細(xì)胞相比，成熟β細(xì)胞的生物標(biāo)志物（例如Pdx1，Mafa和Nkx6.1）在Gm10451敲除的細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平也顯著下調(diào)（圖2G）。 ELISA結(jié)果顯示暴露于不同濃度的葡萄糖導(dǎo)致來自對(duì)照和Gm10451敲除細(xì)胞的胰島素分泌的存在顯著差異。其中，Gm10451敲除的細(xì)胞對(duì)葡萄糖表現(xiàn)出低敏感性，并且產(chǎn)生和分泌較少的胰島素（圖2H）。
三、新型lncRNA Gm10451的鑒定與表征
      細(xì)胞分餾分析表明，Gm10451主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖3A)。熒光原位雜交(FISH)的結(jié)果也與細(xì)胞分餾數(shù)據(jù)一致(圖3B)。使用RACE技術(shù)擴(kuò)增得到了Gm10451從5’到3’末端的序列（圖2C）。作者用qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Gm10451的表達(dá)水平約為每個(gè)細(xì)胞50個(gè)拷貝。此外，發(fā)現(xiàn)新生小鼠的胰腺和肺中富集了Gm10451，這表明Gm10451在胰腺發(fā)育中可能發(fā)揮功能作用（圖2D）。

                                            圖3 新型lncRNA Gm10451的鑒定與表征
四、lncRNA Gm10451促進(jìn)胰島素+ / Nkx6.1 +β樣細(xì)胞在體外分化
      轉(zhuǎn)導(dǎo)72小時(shí)后，相比于NC，過表達(dá)Gm10451細(xì)胞中Gm10451基因表達(dá)水平上調(diào)了3倍多（圖4A）。代表內(nèi)分泌祖細(xì)胞的Nkx6.1 +細(xì)胞群分化為β細(xì)胞的分化率從27.83±0.76％增加到36.03±1.05％（n = 3）（圖4B）。與NC組相比，胰腺β-細(xì)胞分化的關(guān)鍵TF顯著上調(diào)（圖4C）。比較Gm10451過表達(dá)和對(duì)照細(xì)胞中胰島關(guān)鍵標(biāo)志物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩組之間胰島素Glut2，ISL，Pdx1和Mafa的轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異（圖4D）。Gm10451過表達(dá)促使β樣細(xì)胞響應(yīng)低濃度的葡萄糖（5mM）迅速分泌胰島素（圖4E），胰島素分泌在葡萄糖濃度為15-30 mM時(shí)達(dá)到穩(wěn)定水平（圖4E）。胰島素+ / Nkx6.1 +β樣細(xì)胞的數(shù)量從31.3±1.19％顯著增加至49.83±2.02％（n = 3），進(jìn)一步表明Gm10451可作為成熟胰島素分泌細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)劑（圖4F）。

                                           圖4 lncRNA Gm10451促進(jìn)胰島素+ / Nkx6.1 +β樣細(xì)胞在體外分化

五、 mir - 338 - 3 - p調(diào)節(jié)早期β樣 PTIP表達(dá)和抑制細(xì)胞分化
      為了確定哪種miRNA可能參與調(diào)節(jié)PTIP，利用免疫印跡檢測(cè)PTIP水平，結(jié)果顯示miR-338-3p顯著下調(diào)PTIP水平（圖5A）。熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)驗(yàn)證miR-338-3p可以抑制PTIP的翻譯（圖5B）。熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定顯示PTIP的野生型3'-UTR僅在miR-338-3p存在時(shí)翻譯水平較低（圖5C）。突變的3'-UTR對(duì)miR-338-3p沒有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著改變（圖5C）。Nkx6.1 +細(xì)胞群分化率從31.06±1.00％顯著降低至23.13±1.03％（n = 3）（圖5D）。除了PTIP之外，胰腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞的幾個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，例如Pdx1，Nkx6.1，Ngn3，Pax6和Gata6，都顯著下調(diào)（圖5E）。 免疫熒光染色也證明miR-338-3p過表達(dá)在分化早期降低了PTIP，Nkx6.1和Ngn3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（圖5F）。與陰性對(duì)照（21.6±1.51％，n = 3）相比，miR-338-3p敲低部分逆轉(zhuǎn)了Gm10451表達(dá)不足對(duì)損傷分化的影響（圖5G）。

                                       圖5 mir - 338 - 3 - p調(diào)節(jié)早期β樣 PTIP表達(dá)和抑制細(xì)胞分化

六、Gm10451直接結(jié)合miR-338-3p并通過miR-338-3p/PTIP軸調(diào)節(jié)β樣細(xì)胞分化
      在線預(yù)測(cè)Gm10451和miR-338-3p的結(jié)合位點(diǎn)，從484到495（圖.6A）。構(gòu)建Gm10451（LucGm10451-wt）和突變體（Luc-Gm10451-mut）的熒光素酶載體（圖6A）。熒光素酶測(cè)定顯示，miR-338-3p可以抑制Gm10451的熒光素酶活性，但它對(duì)突變的Gm10451的影響較小，這表明Gm10451可以使用預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)與miR-338 3p相互作用（圖6B）。敲除Gm10451會(huì)導(dǎo)致PTIP表達(dá)下調(diào)（圖6C）。Gm10451過表達(dá)導(dǎo)致PTIP表達(dá)上調(diào)（圖6D）。Gm10451中和了miR-338-3p對(duì)PTIP表達(dá)的抑制作用（圖6E）。拯救實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)的Gm10451可逆轉(zhuǎn)PTIP-siRNA對(duì)胰島素+細(xì)胞的抑制作用（圖6F）。qRT-PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)的Gm10451也拯救了PTIP敲除細(xì)胞中重要基因的轉(zhuǎn)錄水平（圖6G），表明Gm10451可通過miR-338-3p / PTIP軸調(diào)節(jié)iPSC衍生的β樣細(xì)胞分化。

                                     圖6 Gm10451直接結(jié)合miR-338-3p并通過miR-338-3p / PTIP軸調(diào)節(jié)β樣細(xì)胞分化
七、胰腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞中PTIP敲除后，全基因組H3K4me3減少
      用siRNA沉默MPC中的PTIP，導(dǎo)致H3K4me3的表達(dá)減少（圖7A）。H3K4me3富集變化的分布餅圖顯示大多數(shù)位于基因間或內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)（圖7B）?；鹕綀D顯示，中101個(gè)基因與H3K4me3相關(guān)性在NC組中比PTIP-siRNA組更多（圖7C）。 GO分析顯示，差異表達(dá)的基因富含多個(gè)生物過程，包括細(xì)胞生物學(xué)和生物體相關(guān)過程，這些過程在β細(xì)胞分化和形成中很重要（圖7D），qRT-PCR驗(yàn)證了Mrpl15，Smyd3，Cnot2，Nrf1，Nr4a1和Igf1r，CHIP-seq結(jié)果顯示它們H3K4me3的富集水平都較低（圖7E）。

                                         圖7胰腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞中PTIP敲除后，全基因組H3K4me3減少

八、 Gm10451沉默的β樣細(xì)胞不能逆轉(zhuǎn)鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的高血糖癥
      為了比較來自NC和Gm10451-siRNA組的β樣細(xì)胞在糖尿病小鼠中的功能，將去細(xì)胞化的大鼠胰腺皮下移植到小鼠的背部（圖8A）。每組大約1×10⁶個(gè)β樣細(xì)胞被植入，在移植后監(jiān)測(cè)空腹血糖水平59天（圖8B）。在移植后29天，種植的NC β樣細(xì)胞小鼠血糖水平恢復(fù)到基線，但注射Gm10451-siRNAβ樣細(xì)胞不能完全逆轉(zhuǎn)高血糖癥。最后，在移植物取出后5天內(nèi)NC β樣細(xì)胞小鼠血糖恢復(fù)至高血糖水平（圖8B）。移植后59天取出移植物，免疫熒光染色顯示與Gm10451-siRNA組相比，NC組含有更多的胰島素+細(xì)胞，并且Nkx6.1和Mafa顯著高表達(dá)（圖8C）。因此，結(jié)果表明Gm10451在體內(nèi)和體外可以通過靶向miR-338-3p作為ceRNA來調(diào)節(jié)PTIP以促進(jìn)iPSC衍生的β樣細(xì)胞分化（圖8D）。

                                   圖8 Gm10451沉默的β樣細(xì)胞不能逆轉(zhuǎn)鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的高血糖癥