環(huán)狀RNA circRHOT1 通過激活NR2F6表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展

桂林醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸科的Liyan Wang，2019 年7月發(fā)表在Molecular Cancer 的一篇文章，IF=10.679。因?yàn)樵絹碓蕉嗟淖C據(jù)表明non-coding RNAs與癌癥進(jìn)展之間存在密切關(guān)系。最近發(fā)現(xiàn)的non-coding RNAs的新成員circRNAs被證明參與多種生物過程，如發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持和病理反應(yīng)。circRNAs在癌癥中的作用近來受到廣泛關(guān)注。目前為止，circRNAs在肝細(xì)胞癌(HCC)中的表達(dá)模式和作用很大程度的基本未知。

技術(shù)路線：

結(jié)果:
一、CircRHOT1 在HCC組織中過度表達(dá)

為了確定在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)至關(guān)重要circRNAs，研究者分析關(guān)于HCC組織中circRNAs分布的數(shù)據(jù)庫。發(fā)現(xiàn)許多circRNAs在HCC組織相比癌旁組織中過度表達(dá)(圖1a)。研究者通過PCR和RNA測序來測定100對HCC組織和癌旁組織中的circRHOT1水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中circRHOT1顯著上調(diào)(圖1b)。選擇5對HCC組織樣本進(jìn)行northern blot驗(yàn)證，結(jié)果顯示circRHOT1在腫瘤組織中顯著過表達(dá)(圖1c)。進(jìn)一步使用生物素標(biāo)記特異性探針的原位雜交(ISH)和熒光原位雜交(FISH)檢測circRHOT1的表達(dá)。結(jié)果顯示，HCC組織中存在更多的circRHOT1(圖1d,e)。采用qRT-PCR檢測了不同分期HCC組織中circRHOT1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示第三階段組織中的表達(dá)比第一/第二階段樣品中的高(圖 1f)。此外，在晚期HCC組織中的表達(dá)高于早期HCC組織(圖 1g)。通過Kaplan–Meier生存分析，研究者發(fā)現(xiàn)HCC患者的circRHOT1表達(dá)較高，預(yù)后較差(圖 1h, i)。綜上所述，研究者的數(shù)據(jù)表明，circRHOT1在HCC組織中高度表達(dá)，并與不良預(yù)后相關(guān)。

圖1 CircRHOT1 在HCC組織中過度表達(dá)。a HCC組織中上調(diào)circRNA的熱圖。在這兩個群體中，circRHOT均顯著上調(diào)和保守。b 100對HCC患者癌癥組織及癌旁組織中circRHOT的相對表達(dá)水平。c使用5對HCC樣本通過northern blot分析circRHOT表達(dá)。（P表示腫瘤周圍；T表示腫瘤。）使用backsplice連接探針檢測到circRHOT1。使用RHOT1特異性探針檢測RHOT1 mRNA。18S是加載對照，用于18S檢測的RNA樣品未用RNA酶處理。d,e用原位雜交(d)和核酸熒光原位雜交(e)使用HCC樣本#1和#4。ISH用比例尺為50 μm，F(xiàn)ISH用比例尺為10 μm  f用qRT-PCR檢測HCC不同臨床階段標(biāo)本中circRHOT的表達(dá)。g用qRT-PCR檢測腫瘤、早期HCC和晚期HCC中circRHOT的相對表達(dá)水平。 h,i 100對HCC樣本根據(jù)circRHOT表達(dá)式分為高組和低組。Kaplan–Meier生存率分析，以確定總生存率(h)和無復(fù)發(fā)生存率(i)。 * p <0.05，** p <0.01和*** p <0.001。所有數(shù)據(jù)代表至少三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，并以平均值SD表示

二、CircRHOT1 基因敲除抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

我們通過CRISPR / Cas9技術(shù)敲除circRHOT1右側(cè)區(qū)域＃3，構(gòu)建了circRHOT1缺失 HCC細(xì)胞系。通過PCR，Northern blot和qRT-PCR（圖2a）證實(shí)了。circRHOT1缺失不影響RHOT1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。然后進(jìn)行了CCK-8、集落形成和EdU摻入試驗(yàn)，以評估circRHOT1對細(xì)胞增殖的影響。如圖所示，circRHOT1敲除顯著抑制細(xì)胞增殖、集落形成和EdU摻入(圖2b-d)。 Transwell分析發(fā)現(xiàn)circRHOT1基因敲除顯著抑制了HCC細(xì)胞的遷移和侵襲(圖2e，f)。此外，circRHOT1缺失顯著促進(jìn)凋亡細(xì)胞百分比(圖2g)，通過檢測Caspase 3/7活性進(jìn)一步證實(shí)(圖2h)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證circRHOT1對HCC細(xì)胞的影響，研究者使其在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)沉默。CCK8、集落形成、EdU摻入、Transwell和FACS的功能性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，circRHOT1敲低抑制了HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，但促進(jìn)細(xì)胞凋亡。用野生型小鼠和缺失circRHOT1的HCC細(xì)胞進(jìn)行異種移植實(shí)驗(yàn)檢測功能性。如圖2i所示. circRHOT1基因敲除顯著降低了腫瘤的重量。此外，用circRHOT 1低表達(dá)或高表達(dá)HCC細(xì)胞的異種移植實(shí)驗(yàn)表明circRHOT 1過表達(dá)促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長(圖2j)?？傊?，circRHOT1促進(jìn)了HCC的發(fā)展。

圖2 CircRHOT1 基因敲除抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，但促進(jìn)凋亡。a用qRT-PCR分析了circRHOT 1基因敲除的HCC細(xì)胞中circRHOT 1的表達(dá)。b-d用CCK-8(b)，集落形成(c)和EdU摻入試驗(yàn)(d)測定circRHOT1對HCC細(xì)胞增殖的影響。e,f通過transwell試驗(yàn)評估了circRHOT1對侵襲（e）和遷移（f）的影響。g膜聯(lián)蛋白V/PI染色，流式檢測HCC細(xì)胞凋亡。h通過使用Caspase 3/7活性細(xì)胞凋亡檢測試劑盒測量Caspase 3/7活性。i將野生型和circRHOT1缺失的HCC細(xì)胞皮下注射到裸受體小鼠中。四周后，測量腫瘤重量。j將circRHOT1低和高表達(dá)的HCC細(xì)胞皮下注射到裸受體小鼠中。四周后，測量腫瘤重量。 * p <0.05，** p <0.01和*** p <0.001。所有數(shù)據(jù)代表至少三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，并以平均值SD表示
三、CircRHOT1 調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞中NR2F6的表達(dá)

RNA測序分析了在circRHOT1缺失后差異表達(dá)的基因，發(fā)現(xiàn)被下調(diào)的基因中NR2F6在HCC細(xì)胞中具有較高表達(dá)值且最顯著下調(diào)(圖3a)?；诒稊?shù)變化和表達(dá)水平選擇了7個下調(diào)基因，通過qRT-PCR驗(yàn)證RNA測序結(jié)果（圖3b）。蛋白質(zhì)印跡顯示NR2F6蛋白水平在circRHOT1缺失的HCC細(xì)胞中顯著降低，circRHOT1主要分布在細(xì)胞核中(圖1d，e)。為了確定circRHOT1是否調(diào)節(jié)NR2F6轉(zhuǎn)錄，研究者用特異性生物素標(biāo)記的circRHOT1探針通過RNA純化(CHIRP)進(jìn)行染色質(zhì)分離，發(fā)現(xiàn)circRHOT1可以富集在NR2F6啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)1000 ~ 800 bp的區(qū)域(圖 3d)。此外，組蛋白活性修飾H3K27Ac的富集在circRHOT1敲除后減少，而H3K27me3的富集增加(圖3e，f)。RNApol在CircRHOT1缺失后不能與NR2F6啟動子結(jié)合(圖 3g)。此外，NR2F6啟動子在circRHOT1缺失的HCC細(xì)胞中對脫氧RNA酶消化更具抗性(圖3h)，表明circRHOT1對NR2F6啟動子是不可或缺的。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在這個區(qū)域缺失后，circRHOT1不能在NR2F6啟動子上富集(圖3I)。此外，研究者發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的circRHOT1提高了NR2F6的基因水平，而結(jié)合區(qū)的缺失消除了這種效應(yīng)(圖3j)。因此，circRHOT1與NR2F6啟動子相關(guān)并促進(jìn)其表達(dá)。

圖3 CircRHOT1 調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞中NR2F6的表達(dá)。a Bland-Altman不同表達(dá)基因圖(log ₂(倍數(shù)變化) > 1.5)，列出了7個選定的基因。紅色圖表示NR2F6。b qRT-PCR檢測了野生型和缺失circRHOT1的HCC細(xì)胞中大多數(shù)下調(diào)基因的表達(dá)。c蛋白質(zhì)印跡檢測NR2F6的表達(dá)。d在HCC細(xì)胞中，通過使用特異性生物素標(biāo)記探針的RNA純化(CHIRP)來分離染色質(zhì)，評估circRHOT1在NR2F6啟動子上的富集。e-g通過WT和circRHOT1缺失的HCC細(xì)胞中的染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）測定在NR2F6啟動子上H3K27Ac（e），H3K27me3（f）和RNA pol II（g）的富集。h通過DNAse I消化評估啟動子可及性。i敲除NR2F6啟動子中circRHOT1的結(jié)合區(qū)域，然后通過CHIRP評估circRHOT1的富集。J  在指定的HCC細(xì)胞中通過qRT-PCR測定NR2F6的mRNA水平。** p ?<0.01和*** p ?<0.001。所有數(shù)據(jù)均代表至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，并以均值±SD表示

四、CircRHOT1 與TIP60的關(guān)系

為了研究circRHOT1是否與特定蛋白合作來調(diào)節(jié)NR2F6的表達(dá)，研究者使用HCC細(xì)胞裂解物進(jìn)行了RNA pull down，然后進(jìn)行銀染和質(zhì)譜鑒定出TIP60是一種潛在的環(huán)狀蛋白1的互作蛋白(圖4a)。此外，用TIP60過表達(dá)的HCC細(xì)胞 pull down RNA顯示生物素標(biāo)記的circRHOT1沉淀標(biāo)志-TIP60(圖 4b)。此外，生物素標(biāo)記的探針circRHOT1可以在野生型HCC細(xì)胞裂解物中沉淀內(nèi)源性TIP60(圖 4c)。此外，特異TIP60抗體在HCC細(xì)胞中富集內(nèi)源性circRHOT1(圖4d)。根據(jù)FISH測定，在HCC細(xì)胞中，circRHOT1與TIP60共定位(圖4e)。RNA-EMSA分析表明，TIP60直接與circRHOT1相互作用(圖4f)。

圖4 CircRHOT1 與TIP60相關(guān)聯(lián)。a將特異性生物素標(biāo)記的circRHOT1探針加入HCC裂解液中，沉淀的蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE分離，進(jìn)行銀染色。通過質(zhì)譜分析(MS)來鑒定環(huán)形探針通道中的差異帶。circRHOT1的反義作為對照，識別出TIP60。b使用TIP60過度表達(dá)的HCC細(xì)胞進(jìn)行RNA pulldown以驗(yàn)證TIP60和大約T1之間的相互作用。生物素標(biāo)記的circRHOT1或反義用于沉淀標(biāo)志-TIP60。c特異性生物素標(biāo)記的circRHOT1探針沒有在circRHOT1敲除的HCC細(xì)胞中沉淀TIP60。d  RNA分子印跡結(jié)果表明，HCC細(xì)胞中TIP60富集約T1。e RNA熒光原位雜交(FISH)顯示，在HCC細(xì)胞中，circRHOT1與TIP60共定位。比例尺，10 μm。f RNA EMSA分析表明，TIP60與circRHOT1直接相互作用。線性circRHOT1用生物素標(biāo)記。所有數(shù)據(jù)代表至少三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，并以平均值SD表示

五、CircRHOT1富集TIP60來激活NR2F6表達(dá)

為了進(jìn)一步確定TIP60是否參與NR2F6表達(dá)的調(diào)節(jié)，研究者用HCC細(xì)胞進(jìn)行了ChIP測定。研究者發(fā)現(xiàn)TIP60在與NRRF1啟動子相同的區(qū)域中與circRHOT1富集（圖5a）。此外，敲除TIP60還抑制H3K27Ac和RNA pol在NR2F6啟動子上的富集(圖5b，c)。此外，TIP60缺失下調(diào)了HCC細(xì)胞NR2F6的基因和蛋白水平(圖 5d，e)。接下來，研究者想確定在TIP60介導(dǎo)的NR2F6表達(dá)中，circRHOT1的作用。研究者發(fā)現(xiàn)CircRHOT1 敲除取消了TIP60在NR2F6啟動子上的富集(圖5f)。DNA FISH還表明，circRHOT1基因敲除消除了TIP60與NR2F6啟動子的共定位(圖 5g)。重要的是，circRHOT1缺陷導(dǎo)致NuA4復(fù)合體的富集失敗NR2F6啟動子，而NuA4復(fù)合物結(jié)合到NR2F6對照HCC細(xì)胞中啟動子(圖5h)。此外，circRHOT1和TIP60的雙重敲除進(jìn)一步抑制了HCC細(xì)胞中NR2F6的基因水平(圖1)。5I)。然后，研究者分析了HCC組織中circRHOT1、TIP60和NR2F6的表達(dá)水平之間的關(guān)系。研究者發(fā)現(xiàn)HCC組織中NR2F6的蛋白和基因水平與TIP60的蛋白和基因水平呈正相關(guān)。5j，k)。此外，HCC組織中NR2F6和circRHOT1的表達(dá)呈正相關(guān)(圖2)?？傊?，CircRHOT1 對HCC組織中TIP60介導(dǎo)的NR2F6表達(dá)是必需的。

圖5  circRHOT1富集TIP60以激活NR2F6表達(dá)。a ChIP實(shí)驗(yàn)表明，TIP60與NR2F6啟動子在與circRHOT1相同的區(qū)域相關(guān)。b,c TIP60敲除顯著降低H2K27Ac的富集(b)和RNA pol II(c)在NR2F6啟動子上。d,e TIP60敲除能顯著抑制基因表達(dá)(d)和蛋白質(zhì)水平(e)在HCC細(xì)胞中的表達(dá)。f,g RNA IP(f)和RNA FISH(g)結(jié)果表明，circRHOT1敲除抑制了HCC細(xì)胞中TIP60與NR2F6啟動子的關(guān)聯(lián)。比例尺，10 μm。h將所示的HCC細(xì)胞裂解并用1%甲醛處理進(jìn)行交聯(lián)。接下來，將anti-TIP60與經(jīng)處理的裂解物一起孵育，用于ChIP分析，隨后分別通過蔗糖梯度超速離心進(jìn)行尺寸分級。洗脫液梯度通過蛋白質(zhì)印跡和PCR檢測。i circRHOT1和TIP60雙敲除對NR2F6基因表達(dá)水平的抑制更為嚴(yán)重。j用蛋白質(zhì)印跡法測定HCC組織中TIP60和NR2F6的蛋白水平。k根據(jù)GSE45436數(shù)據(jù)集，NR2F6的表達(dá)與HCC組織中的circRHOT1和TIP60的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。***p<0.001。所有數(shù)據(jù)代表至少三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，并以平均值SD表示

六、NR2F6的恢復(fù)了circRHOT1缺失介導(dǎo)的HCC生長和轉(zhuǎn)移的抑制

研究發(fā)現(xiàn)NR2F6在HCC癌組織中與癌旁組織的表達(dá)相比上調(diào)(圖6a，b)。研究發(fā)現(xiàn)100對HCC樣本中NR2F6的表達(dá)在腫瘤組織中上調(diào)(圖6c)。免疫組織化學(xué)分析和蛋白質(zhì)印跡證實(shí)HCC組織中NR2F6水平升高(圖6d，e)。此外，NR2F6在HCC患者中的高表達(dá)提示預(yù)后較差(圖6f)。然后研究者敲除NR2F6或恢復(fù)其在circRHOT1缺失的HCC細(xì)胞中的蛋白質(zhì)水平(圖6g)。CCK-8和Transwell分析顯示敲除circRHOT1或NR2F6可抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而在circRHOT1缺失的HCC細(xì)胞中啟動NR2F6可在體外恢復(fù)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲(圖6h-j)。體內(nèi)異種移植實(shí)驗(yàn)表明敲除circRHOT1或NR2F6抑制腫瘤生長。然而，NR2F6恢復(fù)了circRHOT1缺失介導(dǎo)的對腫瘤生長的抑制(圖6k)。因此，研究者的結(jié)果表明，circRHOT 1通過NR2F6的激活抑制HCC進(jìn)程。

圖6  NR2F6的恢復(fù)了circRHOT1缺失介導(dǎo)的HCC生長和轉(zhuǎn)移的抑制。a.c根據(jù)GSE36376數(shù)據(jù)集(a)，GSE25097數(shù)據(jù)集(b)和qRT-PCR結(jié)果(c)與鄰近正常組織相比，在HCC組織中NR2F6 mRNA水平上調(diào)。d,e免疫組織化學(xué)分析(d)和western blotting(e)表明NR2F6蛋白水平在HCC組織中上調(diào)。f Kaplan-Meier生存分析用于評估NR2F6在HCC患者表達(dá)的預(yù)后意義。g 通過在circRHOT1敲除的HCC細(xì)胞中用異位表達(dá)質(zhì)粒的NR2F6轉(zhuǎn)導(dǎo)來恢復(fù)NR2F6蛋白水平。h-j通過CCK-8和Transwell測定評估NR2F6對HCC細(xì)胞增殖（h），遷移（i）和侵襲（j）的影響。 k 通過異種移植測定NR2F6對體內(nèi)腫瘤生長的影響。* p <0.05，** p <0.01和*** p <0.001。所有數(shù)據(jù)均代表至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，并以均值±SD表示
結(jié)論:
綜上所述，circRHOT1通過富集TIP60來抑制HCC的發(fā)展和進(jìn)步NR2F6表達(dá)，表明circRHOT1和NR2F6可能是HCC預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。