Nature immunology揭示LncRNA調(diào)節(jié)抗病毒天然免疫上游通路的新機(jī)制

抗病毒天然免疫中，宿主識(shí)別外源RNA并清除。RIG-I是抗病毒天然免疫中的重要基因，它識(shí)別RNA病毒后聚集于線粒體與MAVS作用，傳遞信息至下游信號(hào)通路，從而激活包括I型干擾素在內(nèi)的抗病毒反應(yīng)通路。作為其中一種RNA病毒感受分子，前人研究中在創(chuàng)新性的發(fā)現(xiàn)了宿主自身也存在lncRNA與之結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性。相關(guān)通路中是否還有結(jié)合lncRNA調(diào)節(jié)方式呢？ 
在前人報(bào)道中， TRIM25結(jié)合RNA后抗病毒反應(yīng)作用增強(qiáng)；而登革熱病毒的RNA能與TRIM25結(jié)合并抑制其功能。該文作者便深入研究了lncRNA對(duì)TRIM25的調(diào)節(jié)作用。最終發(fā)現(xiàn)Lnczc3h7a通過(guò)scaffold作用促進(jìn)TRIM25與RIG-I的結(jié)合，該結(jié)合促進(jìn)了MAVS/IRF3通路的激活。這可能是宿主抵御病毒RNA阻斷RIG-I活性的一種防御方式。

                                                      圖1 研究結(jié)果模式圖和流程圖

作者首先在Flag-TRIM25過(guò)表達(dá)的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7中通過(guò)RIP-Seq檢測(cè)了VSV感染前后與TRIM25相互作用的lncRNAs。然后確立VSV感染后富集豐度最高的20個(gè)lncRNAs為候選指標(biāo)。通過(guò)siRNA在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中逐一敲低相應(yīng)lncRNA后，作者一一檢測(cè)了VSV感染后細(xì)胞相應(yīng)的IFNB1轉(zhuǎn)錄水平變化。敲低編號(hào)RIP.6683的lncRNA后，VSV感染后的IFNB1水平顯著下降。因此作者認(rèn)為該lncRNA參與調(diào)解該過(guò)程。該lncRNA為新發(fā)現(xiàn)lncRNA且被命名為L(zhǎng)nczc3h7a。作者對(duì)其特征進(jìn)行了一系列鑒定：長(zhǎng)603個(gè)核苷酸，含polyA尾，位于小鼠編碼基因Zc3h7a的內(nèi)含子區(qū)域，無(wú)蛋白質(zhì)翻譯。但在人基因組上未能擴(kuò)增出該序列。

                                                   圖2 Lnczc3h7a能與TRIM25結(jié)合
 
作者通過(guò)生物素標(biāo)記的Lnczc3h7a pull down也能檢測(cè)到TRIM25的富集。而且VSV感染后，兩者的相互作用更強(qiáng)。FISH實(shí)驗(yàn)表明，SeV和VSV感染后，Lnczc3h7a表達(dá)量升高；而且Lnczc3h7a與TRIM25共定位。進(jìn)一步檢測(cè)其他病原體刺激后Lnczc3h7a的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，RNA病毒和IFNB1的處理上調(diào)其表達(dá)的作用最為顯著。在細(xì)胞和小鼠模型中敲低和敲除Lnczc3h7a后，作者檢測(cè)到RIG-I介導(dǎo)的下游抗病毒基因在VSV感染后激活水平顯著降低。通路下游激活標(biāo)志p-IRF3水平也顯著下降。這進(jìn)一步證明了Lnczc3h7a對(duì)RIG-I介導(dǎo)的RNA病毒響應(yīng)具有正向調(diào)節(jié)作用。

                                              圖3 Lnczc3h7a促進(jìn)TRIM25下游抗RNA病毒信號(hào)通路的激活
 
Lnczc3h7a過(guò)表達(dá)并不影響TRIM25的寡聚化和泛素化，也不影響MAVS的泛素化。通過(guò)截?cái)鄬?shí)驗(yàn)作者發(fā)現(xiàn)是TRIM25的SPRY結(jié)構(gòu)域與Lnczc3h7a相互作用。過(guò)表達(dá)Lnczc3h7a能促進(jìn)RIG-I的K63泛素化以及RIG-I和TRIM25的共定位。這些結(jié)果表明Lnczc3h7a結(jié)合TRIM25，促TRIM25與RIG-I的結(jié)合以及RIG-I的K63泛素化。

                                           圖4 Lnczc3h7a促進(jìn)TRIM25介導(dǎo)的RIG-I K63泛素化

接下來(lái)，作者開始研究Lnczc3h7a如何調(diào)節(jié)TRIM25與RIG-I的相互作用。在VSV感染后，作者檢測(cè)到Lnczc3h7a和RIG-I的相互作用；而未感染時(shí)則沒(méi)有。在敲除TRIM25后，VSV感染后的Lnczc3h7a與RIG-I相互作用消失。GST-pull down實(shí)驗(yàn)表明Lnczc3h7a與RIG-I的helicase結(jié)構(gòu)域相互作用。而該結(jié)構(gòu)域只在激活后暴露。Pull down實(shí)驗(yàn)也表明Lnczc3h7a主要與活化的寡聚體RIG-I結(jié)合。因?yàn)樵摻Y(jié)構(gòu)域能識(shí)別病毒RNA，所以作者檢測(cè)了Lnczc3h7a是否會(huì)與病毒RNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合該結(jié)構(gòu)域。作者未檢測(cè)到它們之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，這說(shuō)明它們可能各種有不同的結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明了Lnczc3h7a與RIG-I的結(jié)合不能使其激活。

                                           圖5 Lnczc3h7a與活化的RIG-I的解旋酶結(jié)構(gòu)域相結(jié)合
 
通過(guò)iCLIP實(shí)驗(yàn)，作者檢測(cè)到TRIM25結(jié)合位點(diǎn)在Lnczc3h7a的308和311位附近；RIG-I結(jié)合位點(diǎn)在Lnczc3h7a的332位附近。在Lnczc3h7a敲除細(xì)胞中，回復(fù)表達(dá)該區(qū)域刪除突變的Lnczc3h7a均不能回復(fù)其功能，而野生型Lnczc3h7a能回復(fù)其促進(jìn)TRIM25和RIG-I結(jié)合的功能。如圖6c所示，紅色信號(hào)代表TRIM25和RIG-I之間的相互作用。

                              圖6 Lnczc3h7a通過(guò)其308、311和332附近序列促進(jìn)TRIM25和RIG-I之間的相互作用
該文為我們研究lncRNA在信號(hào)通路上游的調(diào)控作用提供了很好的參考。Lnczc3h7a在人基因組同樣位置未檢測(cè)到lncRNA轉(zhuǎn)錄，那人體內(nèi)是否有同樣的調(diào)控機(jī)制和是哪一個(gè)lncRNA分子參與調(diào)解是值得研究的內(nèi)容。同時(shí)，病毒感染后Lnczc3h7a的表達(dá)上升的調(diào)控機(jī)制也是值得關(guān)注的問(wèn)題。