新看點來啦！轉(zhuǎn)錄因子six2促進競爭性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)維持乳腺癌細(xì)胞的干性

已有文獻報道CYP4Z1和假基因CYP4Z2P的表達在乳腺癌中特異性升高。作者此前也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由這些基因介導(dǎo)的競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）網(wǎng)絡(luò)（ceRNET_CC）在乳腺癌血管生成，細(xì)胞凋亡和他莫昔芬抗性中的作用。 但是，ceRNET_CC在調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞干性中的作用以及調(diào)節(jié)ceRNET_CC的機制仍不清楚。這篇文章作者著重解決了這個問題，并于今年9月發(fā)表在影響因子8.731的J. Hematol. Oncol雜志上。

結(jié)果如下：
一、在體外CeRNET_CC促進乳腺癌細(xì)胞的干性
如圖1A, B所示，CYP4Z1和假基因CYP4Z2P在乳腺腫瘤組織中的表達顯著增加。生曲線表明CYP4Z1表達與乳腺癌患者OS呈負(fù)相關(guān)(圖1C)。對CYP4Z1-3'UTR或CYP4Z2P-3'UTR過表達的MCF-7細(xì)胞進行表達譜分析，結(jié)果表明MCF-7細(xì)胞中由CYP4Z1-3'UTR和CYP4Z2P-3'UTR調(diào)節(jié)的基因之間高度重疊（圖1D）。另外，CYP4Z1-3'UTR和CYP4Z2P-3'UTR激活（3854對3788）或抑制（3404對3934）MCF-7細(xì)胞中相似數(shù)量的基因（圖1E，F(xiàn)）。該數(shù)據(jù)集的進一步基因集富集分析（GSEA）顯示，在具有CYP4Z2P-3'UTR過表達的MCF-7細(xì)胞中觀察到干細(xì)胞分化的特征的負(fù)富集（圖1G），與CYP4Z1-3'UTR過表達相關(guān)的陽性信號最多的是胚胎干細(xì)胞功能和成體組織干細(xì)胞模塊（圖1H，I）。功能注釋分析顯示CYP4Z2P-3'UTR或CYP4Z1-3'UTR的過表達激活了調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號傳導(dǎo)途徑（圖1J）。在差異表達的基因中，在CYF4Z2P-3'UTR和CYP4Z1-3'UTR過表達的MCF-7細(xì)胞中鑒定了一組與上皮癌干細(xì)胞相關(guān)的基因特征，包括YY1，KRAS，YAP1和HMGB2（圖1K）。與干細(xì)胞功能的激活一致，檢測到一組細(xì)胞周期增加的相關(guān)基因，即CDK5R1，CDK1，CDK2和CDK7（圖1）。CYP4Z1和CYP4Z2P的表達在臨床乳腺癌樣品中顯示出正相關(guān)（圖1L）。

                                     圖1在體外CeRNET_CC促進乳腺癌細(xì)胞的干性

二、在體內(nèi)ceRNET_CC促進乳腺癌細(xì)胞的腫瘤啟動潛能
盡管所有細(xì)胞系都能以1×10⁶和1×10⁵細(xì)胞的密度形成腫瘤，但CYP4Z1-或CYP4Z2P-3'UTR過表達的細(xì)胞顯示腫瘤大小和重量增加（圖2a-d），敲低 CYP4Z1-或CYP4Z2P-3'UTR降低MCF-7細(xì)胞的腫瘤起始能力（圖2a-f）。CYP4Z1-或CYP4Z2P-3'UTR的敲低顯著降低了MDA-MB-231細(xì)胞的腫瘤起始電位（圖2g-k）。 因此，我們的結(jié)果表明ceRNET_CC可以促進乳腺癌細(xì)胞的干性。

                                     圖2在體內(nèi)ceRNET_CC促進乳腺癌細(xì)胞的腫瘤啟動潛能

三、ceRNET_CC通過hTERT/PI3K/Akt和ERK1/2通路促進乳腺癌細(xì)胞的干性
在CYP4Z1-或CYP4Z2P-3'UTR過表達后，癌癥中的磷脂酰肌醇信號傳導(dǎo)系統(tǒng)和MAPK信號傳導(dǎo)途徑是最高度上調(diào)的途徑（圖3a，b）。如圖3c，d所示，由CYP4Z1-或CYP4Z2P-3'UTR過表達誘導(dǎo)的細(xì)胞球體形成增加或CD44 + / CD24-群體通過sihTERT轉(zhuǎn)染或通過LY-294002或VX-11e處理而減弱。sihTERT，LY-294002或VX-11e處理減弱了由CYP4Z1-或CYP4Z2P-3'UTR過表達誘導(dǎo)的干性標(biāo)志物的表達增加（圖3e，f），敲低hTERT或 LY-294002和VX-11e治療處理降低了p-Akt和p-ERK1 / 2水平。 以上結(jié)果證明ceRNET_CC以依賴于hTERT / PI3K / Akt和ERK1 / 2途徑的方式促進乳腺癌細(xì)胞的干性。

                                  圖3 ceRNET_CC通過hTERT/PI3K/Akt和ERK1/2通路促進乳腺癌細(xì)胞的干性

四、轉(zhuǎn)錄因子six2通過直接調(diào)節(jié)CYP4Z1和假基因CYP4Z2P的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)ceRNET_CC的進展
峰和基序分析顯示5'-TCAG-3'基序高度富集（P = 1e-11）（圖4d），并且六個峰中的大多數(shù)位于啟動子/轉(zhuǎn)錄起始位點（圖4e）。six2占據(jù)了CYP4Z1和CYP4Z2P的啟動子（圖4f）。對具有或不具有six2過表達的MCF-7細(xì)胞進行ChIP測定。結(jié)果表明，six2確實與CYP4Z1和CYP4Z2P的啟動子結(jié)合，并且six2過表達增加啟動子的結(jié)合（圖4g和h）。在乳腺癌組織中，six2和CYP4Z1表達與six2和CYP4Z2P表達呈正相關(guān)（圖4i，j）。 這些結(jié)果表明six2直接結(jié)合CYP4Z1和CYP4Z2P的啟動子，從而增加它們的表達并激活ceRNET_CC。

                                  圖4轉(zhuǎn)錄因子six2通過直接調(diào)節(jié)CYP4Z1和假基因CYP4Z2P的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)ceRNET_CC的進展

五、轉(zhuǎn)錄因子six2促進乳腺癌細(xì)胞的干性
在MCF-7細(xì)胞中觀察到CYP4Z1-3'UTR -或CYP4Z2P-3'UTR和six2調(diào)控的基因表達譜之間存在很大的重疊和正相關(guān)（圖5a和b）。GSEA顯示，six2過表達導(dǎo)致與胚胎干細(xì)胞和乳腺干細(xì)胞功能相關(guān)的基因集富集(圖5f, g)。所有細(xì)胞系都可以在1×10⁶和1×10⁵細(xì)胞密度下形成腫瘤，但是six2過表達的細(xì)胞顯示出腫瘤大小和重量的增加，而six2敲低的細(xì)胞表現(xiàn)出腫瘤大小和重量的減少（圖6a-d）。 此外，在six2過表達或敲低后用MDA-MB-231細(xì)胞進行體內(nèi)致瘤性測定，并證明six2顯著減弱了MDA-MB-231細(xì)胞的腫瘤起始電位（圖6e-i）。 總之，功能獲得和功能喪失測定表明，six2可以促進乳腺癌細(xì)胞的干性。

                                     圖5轉(zhuǎn)錄因子six2在體外促進乳腺癌細(xì)胞的干性

                                      圖6轉(zhuǎn)錄因子six2在體內(nèi)促進乳腺癌細(xì)胞的干性

六、ceRNET_CC對于six2誘導(dǎo)的效應(yīng)是充分必要的
如圖7a-d所示，通過si-Z1和/或si-Z2P轉(zhuǎn)染使由六氧化二過表達誘導(dǎo)的增加的細(xì)胞球體形成，CD44 + / CD24-群體和干性標(biāo)志物表達無效。 CYP4Z1-或CYP4Z2P-3'UTR敲低降低了hTERT，p-Akt和p-ERK1 / 2水平，甚至逆轉(zhuǎn)了6β介導(dǎo)的hTERT，p-Akt和p-ERK1 / 2水平的增加（圖7e）。

                                       圖7 CeRNET_CC對于six2誘導(dǎo)的效應(yīng)是充分必要的

參考文獻：
Zheng Lufeng., Guo Qianqian., Xiang Chenxi., Liu Shijia., Jiang Yuzhang., Gao Lanlan., Ni Haiwei., Wang Ting., Zhao Qiong., Liu Hai., Xing Yingying., Wang Yaohui., Li Xiaoman., Xi Tao., (2019). Transcriptional factor six2 promotes the competitive endogenous RNA network between CYP4Z1 and pseudogene CYP4Z2P responsible for maintaining the stemness of breast cancer cells., J Hematol Oncol, 12, 23.