循環(huán)外泌體非侵入性地監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞

研究背景：
  目前，研究人員正在探索干細(xì)胞和祖細(xì)胞用于再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用；然而，移植后跟蹤細(xì)胞并確定治療效果仍然具有挑戰(zhàn)性。來(lái)自美國(guó)馬里蘭大學(xué)和賓夕法尼亞大學(xué)的研究人員最近在Science Translational Medicine發(fā)表文章“Circulating exosomes derived from transplanted progenitor cells aid the functional recovery of ischemic myocardium”，IF= 17.161。從血液中分離外泌體來(lái)監(jiān)測(cè)心臟梗死后移植到大鼠心臟中的人心肌球源細(xì)胞（cardiosphere-derived cells, CDCs）和心臟祖細(xì)胞（cardiac progenitor cells, CPC）。他們發(fā)現(xiàn)，可以根據(jù)主要組織相容性復(fù)合物錯(cuò)配純化CDC/CPC衍生的外泌體，并且外泌體含有與心肌修復(fù)相關(guān)的microRNA。體外培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的CPC/CDC產(chǎn)生的外泌體的內(nèi)容物與移植到體內(nèi)的細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體的內(nèi)容物不同。該研究表明，循環(huán)外泌體可用于非侵入性地監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞。
  基于干/祖細(xì)胞的療法在臨床前移植和組織損傷模型中發(fā)揮不同程度的疾病治療作用。這些療法現(xiàn)在在人體臨床試驗(yàn)中顯示出有希望的結(jié)果。最近，相關(guān)研究已經(jīng)證明與成人衍生的CPC或CDC相比，來(lái)自人新生兒心臟組織的心臟祖細(xì)胞（CPC; c-kit+/Lin?）和心肌球源細(xì)胞（CDCs）可更好地減少心臟瘢痕大小，改善心功能，并減輕不良的心肌重塑。盡管在成人缺血性心臟病中使用CPC或CDC移植進(jìn)行了1期臨床試驗(yàn)，但增強(qiáng)其臨床療效的一個(gè)主要限制因素是在心肌重塑期間無(wú)法無(wú)創(chuàng)地監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞及其治療效果。
此外，移植的心臟干/祖細(xì)胞的保留率低。干細(xì)胞分泌蛋白組的成分，包括外泌體，通過(guò)供體年齡依賴(lài)性途徑促進(jìn)心肌恢復(fù)。與心臟修復(fù)有關(guān)的外泌體研究的指數(shù)增加突出了這些含有miRNA的小囊泡（30至150 nm）的治療潛力，這些囊泡來(lái)自多泡體與質(zhì)膜的融合。外泌體攜帶修復(fù)受損心臟所需的蛋白質(zhì)，以及miRNA，它們能夠通過(guò)改變靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組來(lái)促進(jìn)長(zhǎng)期修復(fù)。
  盡管CPC或CDC的心肌內(nèi)移植在臨床前研究中挽救了梗死的心肌并改善其功能，但是對(duì)于CPC或CDC的有益作用的潛在機(jī)制尚不清楚。之前，該研究團(tuán)隊(duì)對(duì)CPC分泌組進(jìn)行了深入分析，證明單次心肌內(nèi)注射來(lái)自新生兒CPC的外泌體可促進(jìn)心肌恢復(fù)，與新生兒CPC注射后觀察到的作用相當(dāng)。這些結(jié)果表明，CPC或CDC至少部分治療功效可能歸因于它們的外泌體。此前，已有研究報(bào)道在受體的血漿中觀察到來(lái)自移植的實(shí)體器官的循環(huán)組織特異性外泌體。外泌體含有特異的蛋白質(zhì)組和RNA特征，反映其來(lái)源細(xì)胞的狀態(tài)。
最近，該研究團(tuán)隊(duì)還證明了循環(huán)中移植組織特異性外泌體表征能夠以時(shí)間敏感、條件特異性的方式對(duì)移植的實(shí)體器官進(jìn)行無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)。因此，研究人員假設(shè)移植的干/祖細(xì)胞將外泌體信號(hào)釋放到外周循環(huán)中，干/祖細(xì)胞特異性外泌體的表征將能夠?qū)σ浦布?xì)胞的功能活性和條件狀態(tài)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)。然而，尚不清楚移植的干/祖細(xì)胞衍生的外泌體是否具有與其體外培養(yǎng)的祖/干細(xì)胞類(lèi)似的內(nèi)容物特征，以及是否能夠通過(guò)檢測(cè)和使用這些循環(huán)外泌體用于移植祖細(xì)胞駐留和活性的非侵入性監(jiān)測(cè)。
  干細(xì)胞移植的應(yīng)用因沒(méi)有簡(jiǎn)單高效的無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)靶器官內(nèi)移植細(xì)胞的方法而受到阻礙。該研究假設(shè)在受體血漿中定量和表征移植細(xì)胞衍生的外泌體將能夠?qū)σ浦布?xì)胞的條件活性進(jìn)行可靠的、非侵入性的監(jiān)測(cè)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員使用了一種人-大鼠異種心肌梗死模型，比較了兩種研究較多的祖細(xì)胞類(lèi)型：心肌來(lái)源細(xì)胞（CDCs）和c-kit+心臟祖細(xì)胞（CPC），兩者都來(lái)自接受體外循環(huán)的成人的右心耳（RAA）。

一、CPCs 和 CDCs 在體外和體內(nèi)的功能特征

成人 CPC 和 CDC 移植后大鼠 MI 模型的表型特征和心臟功能評(píng)估。
A．在心臟手術(shù)時(shí)接受冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)治療嚴(yán)重動(dòng)脈粥樣硬化疾病的成年患者（68±10 年）的右心耳（RAA）獲得人體心肌活檢。使用我們先前修改的涉及外植體平板接種，選擇處理和擴(kuò)增的方案，從相同的 RAA 活組織檢查樣品中分離成人CPC 和 CDC。B．針對(duì)干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物（ CD117， CD105， CD90， CD45 和CD31），心臟譜系標(biāo)志物（NKX2.5，肌鈣蛋白 I和 GATA4）和肥大細(xì)胞標(biāo)志物類(lèi)胰蛋白酶的 CPC和 CDC 的流式細(xì)胞術(shù)分析（n = 5）。C．a(chǎn)lamarBlue 測(cè)定CPC 和 CDC 的細(xì)胞增殖（n = 8）。D．當(dāng)兩種祖細(xì)胞類(lèi)型增殖直至 P6 時(shí)，與 CPC 相比，通過(guò)增加的β -半乳糖苷酶活性證實(shí)大多數(shù)成體 CDC 發(fā)生衰老。E． 祖細(xì)胞的另一個(gè)關(guān)鍵功能特性是它們?cè)谝浦驳焦Ｈ募『蟮膬?nèi)在遷移能力。為了在體外重現(xiàn)這種功能活性，通過(guò) transwell遷移測(cè)定法測(cè)量?jī)煞N祖細(xì)胞類(lèi)型的遷移潛力。與 CDC相比， CPCs 遷移能力高。F-I．為了檢查 CPC 的生長(zhǎng)和遷移特性是否與梗塞后恢復(fù)心肌功能的能力提高相關(guān)，來(lái)自相同心臟活組織檢查的 CPC 和 CDC被移植到嚙齒動(dòng)物 MI 模型中。結(jié)扎左前降支（LAD）動(dòng)脈后，將 100 萬(wàn)個(gè) CPC， 1 百萬(wàn)個(gè) CDC 或無(wú)細(xì)胞 Iscove 改良的Dulbecco's 培養(yǎng)基（IMDM）注射到左心室（LV）的受損心肌中。通過(guò)在 MI 后 24 小時(shí)進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查每個(gè)治療組，其在該時(shí)間點(diǎn)在三組中顯示相似的射血分?jǐn)?shù)（EF）。通過(guò)超聲心動(dòng)圖和尸檢組織學(xué)評(píng)估組的心臟功能和 LV 重塑。與培養(yǎng)基對(duì)照相比，移植的 CPC 和 CDC 顯著改善了心臟功能結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為增加的 EF,縮短分?jǐn)?shù)（FS）,舒張末期容量減少（ EDV）,收縮末期容積（ESV）。與 CDC 相比，CPC 的 LV 功能改善顯著更大。J．MI 后 1 周，父母在隨訪的 4 周內(nèi)持續(xù)。通過(guò) MI 后 28 天的組織學(xué)分析進(jìn)一步評(píng)估 LV 的結(jié)構(gòu)變化，重點(diǎn)是纖維化（Masson三色），小動(dòng)脈密度（平滑肌肌動(dòng)蛋白）和總血管密度（異凝集素 IB4）。心肌纖維化的代表性圖像和三種不同治療組的定量。MI 后 4 周，相對(duì)于 IMDM 對(duì)照，用 CPC或 CDC 治療的心臟中梗塞面積（纖維化面積相對(duì)于總?cè)旧募∶娣e）明顯較小，纖維化顯著（CPCs 對(duì) CDC， P <0.0001）降低。盡管CPC 和 CDC 治療均顯著增加了小動(dòng)脈（SMA）和總新生血管密度（IB4）與 IMDM 對(duì)照，在新生血管密度方面， CPC 的表現(xiàn)優(yōu)于 CDC。

二、CDC 群體中增加的 c-kit+化學(xué)計(jì)量提高了治療功效

在體外和體內(nèi)從CPC，CDC和混合細(xì)胞群衍生的培養(yǎng)基（TCM）的功能評(píng)估。
A．基于ELISA的CPCs和CDCs（n = 4至6）體外分泌的7種旁分泌因子的定量分析。B．C. 為了評(píng)估源自 CDC 和 CPC 的 TCM 的血管生成潛力，對(duì)人乳腺上皮細(xì)胞（HMEC）進(jìn)行傷口愈合測(cè)定，保持 TCM 蛋白濃度恒定（蛋白質(zhì)濃度， 50ng /μl）。與 CDC TCM 相比，在存在源自 CPC 的 TCM 的情況下，傷口面積顯著降低.D. E. 改為非指定生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方, CDC 和 CPC 導(dǎo)致早期發(fā)病衰老，細(xì)胞增殖減少和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物丟失（CD90 和 CD105）.F. 們?cè)谄涮幏脚囵B(yǎng)基中培養(yǎng) CPC 和 CDC，并在體外測(cè)定或心肌內(nèi)注射到大鼠 MI 模型之前調(diào)節(jié) CDC群體內(nèi)的 c-kit+細(xì)胞比例。劃痕遷移測(cè)定證明，增加 CDC 中 c-kit+細(xì)胞比例逐漸增強(qiáng)傷口愈合。G.H. 從具有不同比例的 c-kit+細(xì)胞的 CDC 收獲 TCM。通過(guò) ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SDF-1a 和 VEGFA 在以下情況下會(huì)增加 c-kit+細(xì)胞濃度。I.J測(cè)試了這些肌肉的心肌恢復(fù)潛力。研究人員建立的嚙齒動(dòng)物 MI 模型中的結(jié)合組，同時(shí)保持恒定的移植細(xì)胞總數(shù)（100 萬(wàn)）。隨著 c-kit+細(xì)胞濃度的增加，EF 和 FS 顯著增加。

三、CPC和CDC將含有祖細(xì)胞特異性的人主要組織相容性復(fù)合物的外泌體釋放到受體血漿中

在注射CPC或CDC后體外從大鼠血漿中獲得的CPCs和CDC的外泌體的表征。
A．透射電子顯微鏡（TEM）示意圖，分離的細(xì)胞外囊泡外泌體的大小標(biāo)記物 CD63。B．與 CPC 衍生的外泌體相比，使用 CD63結(jié)合磁珠的流式細(xì)胞術(shù)證實(shí) CDC 衍生的外泌體上表現(xiàn)出更高的 CD63 表達(dá)。C．通過(guò)納米粒子追蹤分析（NTA）對(duì)這些外泌體的進(jìn)一步表征顯示， CDC 衍生的外泌體不僅比 CPC 衍生的外泌體更大（平均大小，165nm），濃度也更高。D．E. 在具有相等和恒定數(shù)量的外泌體的基礎(chǔ)上，CPC 衍生的外泌體在 HMEC 中誘導(dǎo)更多的增殖，并且與 CDC 衍生的外泌體相比表現(xiàn)出更多的血管生成潛力。我們得出結(jié)論，盡管數(shù)量較少，CPC 衍生的外泌體可能比 CDC 衍生的外泌體更有效用于心肌修復(fù)。F． 從 CDC 和CPC 分離的外泌體中的干細(xì)胞標(biāo)記物和心臟相關(guān)蛋白的免疫印跡。G.  在培養(yǎng)物中對(duì)來(lái)自CDC 或 CPC 的外來(lái)體進(jìn)行體外測(cè)試，并在外泌體上檢測(cè) HLA-A特異性信號(hào).H.  在體內(nèi)，祖細(xì)胞特異性外泌體信號(hào)在總體內(nèi)在祖細(xì)胞移植后 2 和 7 天，在受體大鼠血漿中定量外泌體。選擇這些時(shí)間點(diǎn)是因?yàn)槲覀冎暗姆治霰砻?，盡管大多數(shù)移植的祖細(xì)胞丟失，但在移植后 7 天觀察到受損心肌的心臟功能改善. 在第 7 天， IMDM（陰性對(duì)照）， CDC 和 CPC組中血漿外泌體的總數(shù)相似，但僅在 CDC 和 CPC 組中檢測(cè)到祖細(xì)胞特異性外泌體信號(hào).I.  與 CDC 衍生的外泌體相比，在 CPC 衍生的外泌體中觀察到約兩倍更高的祖細(xì)胞特異性 HLA-A 外來(lái)體信號(hào).J.我們?cè)u(píng)估了循環(huán)祖細(xì)胞外泌體是否共表達(dá) MHC 和其他表面標(biāo)志物和反映 CDC 和 CPC 細(xì)胞成分的蛋白質(zhì)。術(shù)后天（POD）2 和 7 從大鼠血漿中純化的人祖細(xì)胞特異性外泌體的免疫印跡分析表明，在兩個(gè)選定的時(shí)間點(diǎn)，移植的細(xì)胞特異性外泌體亞群表達(dá) HLA 分子（HLA-A 和 HLA A1） ， flotillin 1（外來(lái)體標(biāo)記物），c-kit（祖細(xì)胞標(biāo)記物）和心肌細(xì)胞標(biāo)記物肌鈣蛋白 I.

四、循環(huán)中源自移植細(xì)胞的外泌體miRNA的PLSR和功能分析

  為了在體內(nèi)非侵入性地監(jiān)測(cè)移植的CDC或CPC的活性，研究人員從受體總血漿外泌體中純化了祖細(xì)胞特異性外泌體。移植后7天，與CDC特異性外泌體相比，血漿CPC特異性外泌體的濃度增加約兩倍。生物信息學(xué)的通路分析未能將CPC或CDC細(xì)胞mRNA與觀察到的心肌修復(fù)聯(lián)系起來(lái)，但與受體血漿中純化的CPC外泌體的miRNA有關(guān)。研究進(jìn)一步確定了與移植的CPC相關(guān)的心肌修復(fù)的機(jī)制。

五、通過(guò)計(jì)算分析預(yù)測(cè) miRNA 功能的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

通過(guò)計(jì)算分析鑒定的 miRNA 的功能作用的驗(yàn)證。（A）使用 alamarBlue 測(cè)定法評(píng)估 miRNA 對(duì)細(xì)胞增殖的影響。如圖所示，用模擬物，抑制劑或模擬物+ miR-378， miR- 384， miR-515， miR-525 和 miR-1224 的抑制劑轉(zhuǎn)染 HMEC。（B 和 C） Transwell 遷移測(cè)定圖像和定量評(píng)估用模擬物，抑制劑或模擬物+ miR-378， miR-384， miR-515， miR-525和 miR-1224 的抑制劑轉(zhuǎn)染的 HMEC 的遷移潛力。（D 和 E）傷口愈合測(cè)定圖像和用模擬物處理的 HMEC 的量化抑制劑，或 miR-378， miR-384 的模擬物+抑制劑，miR 模384仿miR 抑384制劑miR 模仿378384515+抑制劑miR-515， miR-525 和 miR-1224。所有數(shù)據(jù)都有代表作為平均值±SEM。 * P <0.05， ** P <0.01， *** P <0.001， 和****P < 0.0001.使用單向 ANOVA 分析數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行 Tukey 分析（A，C 和 E） 。
   總之，該研究證明祖細(xì)胞特異性外泌體存在于受體循環(huán)中并且可以非侵入性地監(jiān)測(cè)。在異種嚙齒動(dòng)物MI模型中進(jìn)行了head-to-head比較，以研究來(lái)自相同人類(lèi)心臟活檢的兩個(gè)充分研究的祖細(xì)胞，CDC和CPC的心臟修復(fù)潛力。驗(yàn)證了干/祖細(xì)胞特異性外泌體的監(jiān)測(cè)潛力，并證明外泌體miRNA反映了移植干細(xì)胞的功能性心肌修復(fù)。這些發(fā)現(xiàn)證明了循環(huán)中祖細(xì)胞特異性外泌體作為液體活檢的潛力，其為移植細(xì)胞的狀態(tài)提供了非侵入性監(jiān)測(cè)的方案。這些數(shù)據(jù)揭示了細(xì)胞特異性外泌體對(duì)同種異體細(xì)胞療法的監(jiān)測(cè)潛力。