circTRIM33-12作為MicroRNA-191的吸附海綿起到抑制肝細(xì)胞癌的作用

   肝細(xì)胞癌（HCC）是全球排名第三的死亡相關(guān)癌癥，HCC的臨床特征是其侵襲性，預(yù)后不良和治療機(jī)會有限。近期, 復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院研究團(tuán)隊在Molecular Cancer期刊上發(fā)表了一題名為：Circular RNA circTRIM33–12 acts as the sponge of MicroRNA-191 to suppress hepatocellular carcinoma progression的文章。該文章主要講述了circTRIM33-12可以作為致癌miR-191的吸附海綿起作用以上調(diào)TET1表達(dá)并因此抑制HCC進(jìn)展。

一、在HCC中調(diào)節(jié)TRIM33衍生的circTRIM33-12
   TRIM33是一種腫瘤抑制基因，TRIM33在HCC中的下調(diào)是由TRIM33啟動子中CpG島的高度甲基化引起的，表明源自TRIM33的circRNA表達(dá)可能在HCC細(xì)胞中下調(diào)。作者通過qRT-PCR分析了四對HCC組織樣品中18種TRIM33來源的circRNA。在四個HCC腫瘤組織中的circTRIM33-12（hsa_circRNA8662-12）表達(dá)顯著降低。circTRIM33-12由TRIM33外顯子12-18組裝而成。為了進(jìn)一步研究circTRIM33-12表達(dá)對HCC患者的預(yù)后意義，對200例HCC及癌旁組織進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證circTRIM33-12的表達(dá)。與癌旁組織相比，116例（58%）HCC組織中circTRIM33-12表達(dá)顯著降低。以circTRIM33-12的表達(dá)中間值為節(jié)點(diǎn)，對HCC組織進(jìn)行高表達(dá)與低表達(dá)劃分。分析circTRIM33-12表達(dá)與HCC患者臨床病理特征之間的關(guān)系，與高表達(dá)的患者相比，cirTRIM33-12 表達(dá)量低的 HCC患者腫瘤大小較大（P ?= 0.022），腫瘤數(shù)量多（P ?= 0.028），侵襲強(qiáng)（P ?= 0.007）。對這200例患者進(jìn)行術(shù)后生存和術(shù)后復(fù)發(fā)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)cirTRIM33-12低表達(dá)患者生存期顯著高于高表達(dá)患者，手術(shù)復(fù)發(fā)顯著低于高表達(dá)患者。

二、circTRIM33-12抑制HCC細(xì)胞的增殖和侵襲
   從7種HCC細(xì)胞系中篩選circTRIM33-12低表達(dá)細(xì)胞系，選取SMMC-7721和HCCLM3進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。與對照組相比，過表達(dá)circTRIM33-12后SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移顯著受到抑制。敲低circTRIM33-12促進(jìn)了高表達(dá)細(xì)胞系Huh 7和MHCC97L細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。為了進(jìn)一步探索circTRIM33-12在體內(nèi)的作用，將過表達(dá)的SMMC-7721和對照組種植到小鼠肝內(nèi)。過表達(dá)的腫瘤體積和轉(zhuǎn)移能力顯著低于對照組。

三、circTRIM33-12可作為miR-191的吸附海綿
   Huh 7細(xì)胞中用針對AGO2的抗體進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)，circTRIM33-12對AGO2抗體有明顯富集作用，表明可作為AGO2和miRNA的結(jié)合平臺。使用數(shù)據(jù)庫預(yù)測到11個可能與circTRIM33-12結(jié)合的潛在miRNA。這11種miRNA中有三種是癌基因，分別是miR-23a-3p，miR-191和miR-224-5p。為了進(jìn)一步研究circTRIM33-12與這三種miRNA結(jié)合，構(gòu)建含有熒光素酶基因的circTRIM33-12表達(dá)質(zhì)粒載體，并將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染到Huh 7細(xì)胞中。觀察到轉(zhuǎn)染后3種miRNA減少，特別的miR-191顯著減少。使用生物素標(biāo)記的miR-191進(jìn)行pulldown實(shí)驗(yàn)，與NC組相比miR-191對circTRIM33-12有明顯富集作用。對miR-191敲低過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)circTRIM33-12表達(dá)沒有變化；circTRIM33-12過表達(dá)后，miR-191表達(dá)也沒有變化。這說明circTRIM33-12和miR-191可能不會相互降解。這些實(shí)驗(yàn)表明，circTRIM33-12可以作為miR-191的吸附海綿起作用。

四、circTRIM33-12通過海綿miR-191上調(diào)TET1表達(dá)
   一些研究顯示，TET1，TIMP3，SATB1和DIECR1受miR-191影響。但是在炎癥細(xì)胞系中上調(diào)或敲低miR-191對它們的mRNA和蛋白表達(dá)水平?jīng)]有改變，但是對TET1蛋白表達(dá)有影響。使用熒光素酶報告法檢測TET1 mRNA的3'UTR是否是HCC細(xì)胞中miR-191的靶標(biāo)，結(jié)果表明miR-191和TET1 mRNA在HCC細(xì)胞中的直接相互作用。為了驗(yàn)證circTRIM33-12對TET1表達(dá)的影響，過表達(dá)circTRIM33-12，檢測TET1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果表明，circTRIM33-12的過表達(dá)顯著增加TET1蛋白水平而不是mRNA水平。circTRIM33-12的敲低顯著降低TET1蛋白水平而不是mRNA水平。熒光素酶活性測定表明敲低circTRIM33-12后，TET1活性下降；circTRIM33-12與miR-191一起敲低后，TET1活性無影響。circTRIM33-12過表達(dá)后，TET1活性增強(qiáng)；circTRIM33-12過表達(dá)同時miR-191敲低后，TET1活性無影響。在200例HCC患者組織使用qRT-PCR和IHC驗(yàn)證TET1的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在HCC患者中circTRIM33-12和TET1之間呈正相關(guān)關(guān)系。

五、circTRIM33-12和TET1負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)5hmC的表達(dá)
   在circTRIM33-12和TET1過表達(dá)的SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞中比較5mC和5hmC水平，發(fā)現(xiàn)在circTRIM33-12-或TET1-過表達(dá)細(xì)胞中5hmC的水平顯著增加；相反，，在circTRIM33-12或TET1敲低的Huh 7和MHCC97L細(xì)胞中5hmC的水平顯著降低。并且過表達(dá)TET1的細(xì)胞細(xì)胞增殖和侵襲遷移能力明顯減弱。結(jié)果與第二部分完全結(jié)果一致，。這些數(shù)據(jù)證明了circTRIM33-12作為miR-191的吸附海綿抑制HCC進(jìn)展，通過circTRIM33-12 / miR-191 / TET1軸抑制miR-191致癌作用。

六、TET1負(fù)調(diào)節(jié)癌基因表達(dá)并與免疫逃避有關(guān)
   接下來試圖研究TET1敲低是否轉(zhuǎn)錄抑制HCC細(xì)胞中的腫瘤抑制基因表達(dá)。RNA-seq結(jié)果顯示，TET1敲低下調(diào)了幾種參與腫瘤進(jìn)展的腫瘤抑制基因，如WWC家族成員3（WWC3），腫瘤蛋白p53誘導(dǎo)核蛋白1（TP53INP1），UL16結(jié)合蛋白1（ULBP1）和賴氨酸脫甲基酶7A（JHDM1D）。為了研究circTRIM33-12是否通過miR-191 / TET1軸發(fā)揮其生物學(xué)功能，在circTRIM33-12和TET1敲低或過表達(dá)的HCC細(xì)胞中檢測WWC3 、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D的表達(dá)。敲低circTRIM33-12或TET1顯著減少了WWC3 、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D的表達(dá)。過表達(dá)circTRIM33-12或TET1增加WWC3 、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D mRNA和蛋白表達(dá)水平。使用熒光素酶報告基因測定驗(yàn)證WWC3 、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D mRNA的3'UTR是否是miR-191的靶標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)熒光素酶活性無明顯變化，這就說明WWC3 、TP53INP1、ULBP1和JHDM1D mRNA的3'UTR不是miR-191的靶標(biāo)。為了進(jìn)一步探討circTRIM33-12與免疫逃避之間的關(guān)系，檢測200例HCC癌和癌旁組織中NKG2D的表達(dá)。在HCC組織中NKG2D陽性細(xì)胞的數(shù)目與癌旁組織相比較顯著降低。散點(diǎn)圖分析揭示了在HCC組織中circTRIM33-12表達(dá)和NKG2D陽性細(xì)胞數(shù)之間呈正相關(guān)性。這些結(jié)果表明，circTRIM33-12可通過海綿吸附作用miR-191保護(hù)TET1而發(fā)揮其抗腫瘤作用。

七、miR-191的敲低改變了circTRIM33-12的敲低并誘導(dǎo)了HCC細(xì)胞的進(jìn)展
   接下來探討了miR-191的敲低是否影響了cirTRIM33-12敲低的HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。在敲低cirTRIM33-12的細(xì)胞系中，敲低miR-191 ，TET1蛋白表達(dá)升高，mRNA表達(dá)無變化。在敲低cirTRIM33-12的細(xì)胞系中，miR-191的敲低顯著降低了HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

結(jié)論：
   在HCC組織中circTRIM33-12表達(dá)顯著降低，并且低水平的circTRIM33-12表達(dá)與HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)。circTRIM33-12通過吸附miR-191并上調(diào)TET1表達(dá)抑制HCC增殖、轉(zhuǎn)移和免疫逃避，表明其在HCC進(jìn)展中的腫瘤抑制作用。為HCC靶向治療提供了新的靶點(diǎn)。