lncRNA HOTAIR促進(jìn)外泌體分泌的機(jī)制研究

   有研究表明腫瘤細(xì)胞在腫瘤發(fā)生過程中釋放大量傳遞信息的外泌體。而外泌體分泌是由某些相關(guān)分子調(diào)節(jié)的多步驟過程。lncRNA在肝細(xì)胞癌（HCC）進(jìn)展中起重要作用，但是lncRNA HOTAIR在調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞中外泌體分泌中的作用仍不清楚。近期發(fā)表在Molecular Cancer（IF：10.679）雜志上的一篇文章介紹了HCC細(xì)胞中lncRNA HOTAIR促進(jìn)外泌體分泌的機(jī)制。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：
1、HOTAIR異常表達(dá)與外泌體分泌相關(guān)
圖1A是鑒定出的與外泌體相關(guān)的31個(gè)編碼蛋白。依據(jù)中位數(shù)將374例肝癌患者分為HOTAIR高表達(dá)和HOTAIR低表達(dá)兩組，GSEA的結(jié)果顯示外泌體分泌相關(guān)的蛋白與HOTAIR高表達(dá)相關(guān)聯(lián)（圖1B）。RAB35, SNAP23和VAMP3的表達(dá)在腫瘤中顯著上調(diào)（圖1C-E）。

2、在肝癌細(xì)胞中HOTAIR促進(jìn)外泌體釋放
透射電鏡分析純化的外泌體（圖2A），構(gòu)建過表達(dá)的HOTAIR細(xì)胞系，檢測外泌體標(biāo)志物CD63和TG101的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HOTAIR后，外泌體中CD63和TG101表達(dá)都升高了（圖2B）。NTA表明釋放的外泌體大小約為100 nm（圖2C）。過表達(dá)HOTAIR后，細(xì)胞分泌的外泌體也增多了。

3、HOTAIR增強(qiáng)了多泡體（MVBs）向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)
過表達(dá)HOTAIR導(dǎo)致CD63在離細(xì)胞核更遠(yuǎn)的地方分布(圖3A)，同時(shí)也增加了CD63與SNAP-23的共定位（圖3B），還增加了細(xì)胞中MVB的量（圖3C）。說明HOTAIR增強(qiáng)了多泡體（MVBs）向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。

4、HOTAIR調(diào)控RAB35表達(dá)與定位
篩選Rab GTPases（介導(dǎo)MVB運(yùn)輸）的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)HOTAIR的細(xì)胞系中，RAB35的表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖4A）。過表達(dá)HOTAIR，使RAB35染色增強(qiáng)，CD63與RAB35的共定位增強(qiáng)（圖4 B）。RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照IgG相比，Rab35抗體顯著富集HOTAIR(圖4C)。HOTAIR促進(jìn)外泌體分泌的作用在轉(zhuǎn)染HOTAIR和siRAB35之后時(shí)效了（圖4D）。說明HOTAIR通過調(diào)控RAB35的表達(dá)和定位來促進(jìn)MVBs的運(yùn)動(dòng)。

5、HOTAIR誘導(dǎo)VAMP3和SNAP23異位
與對照相比，過表達(dá)HOTAIR誘導(dǎo)SNAP23向質(zhì)膜擴(kuò)散（圖5 A），同時(shí)增加VAMP3和SNAP23共定位（圖5B），說明HOTAIR可以通過影響SNAP23復(fù)合物加速MVBs與質(zhì)膜的融合。

6、HOTAIR通過SNAP23的磷酸化促進(jìn)外泌體的釋放
鑒于前人的研究外泌體釋放依賴于SNAP23的磷酸化，因此用反磷酸化實(shí)驗(yàn)研究HOTAIR是否可以影響SNAP23的磷酸化。與陰性對照組相比，HOTAIR過表達(dá)顯著增加了p-SNAP23/SNAP23的比例(圖6A)，說明HOTAIR可以誘導(dǎo)SNAP23磷酸化。挽救實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞與雷帕霉素（SNAP23調(diào)節(jié)抑制劑）共處理時(shí)，HOTAIR誘導(dǎo)SNPA23磷酸化的作用減弱(圖6B)。上述表明HOTAIR可以通過SNAP23的磷酸化促進(jìn)外泌體的釋放。