lncRNA HOTAIR促進外泌體分泌的機制研究

   有研究表明腫瘤細胞在腫瘤發(fā)生過程中釋放大量傳遞信息的外泌體。而外泌體分泌是由某些相關(guān)分子調(diào)節(jié)的多步驟過程。lncRNA在肝細胞癌（HCC）進展中起重要作用，但是lncRNA HOTAIR在調(diào)節(jié)HCC細胞中外泌體分泌中的作用仍不清楚。近期發(fā)表在Molecular Cancer（IF：10.679）雜志上的一篇文章介紹了HCC細胞中lncRNA HOTAIR促進外泌體分泌的機制。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：
1、HOTAIR異常表達與外泌體分泌相關(guān)
圖1A是鑒定出的與外泌體相關(guān)的31個編碼蛋白。依據(jù)中位數(shù)將374例肝癌患者分為HOTAIR高表達和HOTAIR低表達兩組，GSEA的結(jié)果顯示外泌體分泌相關(guān)的蛋白與HOTAIR高表達相關(guān)聯(lián)（圖1B）。RAB35, SNAP23和VAMP3的表達在腫瘤中顯著上調(diào)（圖1C-E）。

2、在肝癌細胞中HOTAIR促進外泌體釋放
透射電鏡分析純化的外泌體（圖2A），構(gòu)建過表達的HOTAIR細胞系，檢測外泌體標志物CD63和TG101的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達HOTAIR后，外泌體中CD63和TG101表達都升高了（圖2B）。NTA表明釋放的外泌體大小約為100 nm（圖2C）。過表達HOTAIR后，細胞分泌的外泌體也增多了。

3、HOTAIR增強了多泡體（MVBs）向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運
過表達HOTAIR導致CD63在離細胞核更遠的地方分布(圖3A)，同時也增加了CD63與SNAP-23的共定位（圖3B），還增加了細胞中MVB的量（圖3C）。說明HOTAIR增強了多泡體（MVBs）向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運。

4、HOTAIR調(diào)控RAB35表達與定位
篩選Rab GTPases（介導MVB運輸）的表達時發(fā)現(xiàn)，在過表達HOTAIR的細胞系中，RAB35的表達水平顯著上調(diào)（圖4A）。過表達HOTAIR，使RAB35染色增強，CD63與RAB35的共定位增強（圖4 B）。RIP實驗結(jié)果顯示，與對照IgG相比，Rab35抗體顯著富集HOTAIR(圖4C)。HOTAIR促進外泌體分泌的作用在轉(zhuǎn)染HOTAIR和siRAB35之后時效了（圖4D）。說明HOTAIR通過調(diào)控RAB35的表達和定位來促進MVBs的運動。

5、HOTAIR誘導VAMP3和SNAP23異位
與對照相比，過表達HOTAIR誘導SNAP23向質(zhì)膜擴散（圖5 A），同時增加VAMP3和SNAP23共定位（圖5B），說明HOTAIR可以通過影響SNAP23復合物加速MVBs與質(zhì)膜的融合。

6、HOTAIR通過SNAP23的磷酸化促進外泌體的釋放
鑒于前人的研究外泌體釋放依賴于SNAP23的磷酸化，因此用反磷酸化實驗研究HOTAIR是否可以影響SNAP23的磷酸化。與陰性對照組相比，HOTAIR過表達顯著增加了p-SNAP23/SNAP23的比例(圖6A)，說明HOTAIR可以誘導SNAP23磷酸化。挽救實驗表明當轉(zhuǎn)染細胞與雷帕霉素（SNAP23調(diào)節(jié)抑制劑）共處理時，HOTAIR誘導SNPA23磷酸化的作用減弱(圖6B)。上述表明HOTAIR可以通過SNAP23的磷酸化促進外泌體的釋放。