看METTL3介導(dǎo)的m6A如何作用于胃癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2020-01-03
N6-甲基腺苷(m6A)修飾是真核mRNA中最常見的化學(xué)修飾之一,對mRNA的穩(wěn)定性,剪接和翻譯產(chǎn)生重要影響......

   N6-甲基腺苷(m6A)修飾是真核mRNA中最常見的化學(xué)修飾之一,對mRNA的穩(wěn)定性,剪接和翻譯產(chǎn)生重要影響。最近,人們越來越認(rèn)識到m6A在腫瘤發(fā)生中的調(diào)節(jié)作用。然而,m6A的失調(diào)及其在腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和轉(zhuǎn)移中的功能仍然不清楚。該研究采用qRT-PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測胃癌(GC)中METTL3的表達(dá)。通過體外和體內(nèi)試驗研究了METTL3對GC轉(zhuǎn)移的影響。通過轉(zhuǎn)錄組測序,m6A測序,m6A甲基化RNA免疫定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(MeRIP qRT-PCR),共聚焦免疫熒光測定,熒光素酶報告基因測定,共免疫沉淀,RNA免疫沉淀和染色質(zhì)免疫沉淀測定等方法探索了METTL3的作用機(jī)理。


結(jié)果:
一、METTL3過表達(dá)及其在GC中的預(yù)后價值

   通過臨床數(shù)據(jù)集TCGA(癌癥基因組圖譜)和GSE66229,發(fā)現(xiàn)GC組織中METTL3 mRNA表達(dá)顯著升高,胃癌組織中METTL14表達(dá)降低,且兩個數(shù)據(jù)集中的其他m6A“writers” 和 “erasers”水平不一致(圖1a,b)。qRT-PCR驗證了由60對GC組織中METTL3的mRNA水平明顯過表達(dá)(圖1c),METTL3在晚期(III-IV)的GC組織中明顯更高(圖1d),GC組織中觀察到m6A mRNA的水平升高(圖1e)。免疫組化檢查了120例的GC組織微陣列樣品中METTL3的蛋白水平。METTL3顯著地定位在GC細(xì)胞核中(圖1f)。Kaplan-Meier曲線顯示,具有METTL3高表達(dá)的患者表現(xiàn)出較差的總生存期(OS)和無病生存期(DFS)(圖1g,h)。總之,METTL3在GC中明顯過表達(dá),可能與GC進(jìn)展有關(guān)。


二、EMT需要METTL3
   免疫組化連續(xù)切片染色顯示GC組織中METTL3的表達(dá)水平似乎與E-鈣粘蛋白負(fù)相關(guān),而與N-鈣粘蛋白和波形蛋白正相關(guān)(圖2a)。MKN-28細(xì)胞系顯示E-鈣粘蛋白的高表達(dá),而N-鈣粘蛋白和波形蛋白的水平低,這是其上皮表型的代表(圖2b)。為驗證EMT程序是否需要METTL3,進(jìn)行了功能喪失和功能獲得研究(圖2c,d)。敲低METTL3會導(dǎo)致N-鈣粘蛋白和波形蛋白的顯著下調(diào),同時在BGC823和AGS細(xì)胞中蛋白質(zhì)水平上E-鈣粘蛋白的顯著上調(diào)。METTL3的過表達(dá)在MKN-28細(xì)胞中引起相反的結(jié)果(圖2e),METTL3的敲低或過表達(dá)分別也降低或增加了GC細(xì)胞中總體m6A修飾水平(圖2f,g)??傊琈ETTL3促進(jìn)了GC細(xì)胞中的EMT程序。


三、METTL 3促進(jìn)胃癌細(xì)胞在體內(nèi)外的侵襲和轉(zhuǎn)移
   通過傷口愈合實驗顯示METTL 3表達(dá)的減弱明顯抑制了BGC 823細(xì)胞的遷移能力(圖3a),METTL 3的強(qiáng)制表達(dá)明顯增加了MKN-28細(xì)胞的遷移速度(圖3b)。Transwell侵襲實驗證實,敲除METTL 3基因后,GC細(xì)胞的侵襲能力受到明顯抑制(圖 3C),而METTL 3的異位表達(dá)則顯著地增強(qiáng)了它的表達(dá)(圖3d)。研究發(fā)現(xiàn)BGC 823-shRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裸鼠肺部的效果不如對照組(圖3e,f)。METTL 3的過表達(dá)明顯增加了MKN-28細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)(圖3g,h)。小鼠原位模型實驗,在裸鼠胃漿膜下注射穩(wěn)定的MKN-28細(xì)胞,GC細(xì)胞植入后5周觀察腫瘤浸潤肌層和粘膜發(fā)現(xiàn)METTL 3高表達(dá)組的腫瘤比對照組大。此外,METTL 3過表達(dá)組可觀察到肝轉(zhuǎn)移灶,但不在對照中(圖3i-k)。表明METTL3在促進(jìn)GC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。



四、轉(zhuǎn)錄組-測序和m6A-測序鑒定ZMYM 1是METTL 3的直接靶點(diǎn)
   通過轉(zhuǎn)錄組測序比較在BGC 823細(xì)胞中敲除METTL 3后的基因表達(dá)譜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)798個基因被顯著下調(diào),662個基因被顯著上調(diào)(圖4a,b)。通過m6A測序鑒定了9465和8794 m6A峰對照和METTL3-缺陷細(xì)胞(圖4c)。在BGC823細(xì)胞中,METTL3穩(wěn)定敲低,發(fā)現(xiàn)850個峰減少(圖4d)。在BGC 823細(xì)胞中映射m6A甲基體時,在免疫純化的RNA中,m6A共識序列GGAC(R RACH)基序在m6A位點(diǎn)中高度富集(圖4e)。與以前的研究一致,我們證明了m6A信號。 L在mRNAs的終止密碼子附近富集(圖4f)。用798個下調(diào)的基因過濾掉850個減少的m6A峰,從而鑒定出由13個基因帶來的15個峰(圖4g)。在這13個潛在的調(diào)節(jié)因子中,我們的重點(diǎn)是ZMYM1,因為在sh-NC BGC823細(xì)胞中在其mRNA的終止密碼子附近檢測到兩個m6A峰,并且在METTL3敲低后均被減弱(圖4h)。ZMYM 1的生物學(xué)功能尚不清楚,因此選擇了ZMYM1作為METTL 3介導(dǎo)的m6A修飾的候選靶點(diǎn)。


五、METTL 3在GC中維持ZMYM 11的表達(dá)
   與基因表達(dá)數(shù)據(jù)一致,分別在mRNA和蛋白水平上ZMYM1的表達(dá)被下調(diào)或上調(diào)的METTL3的敲低或過表達(dá)(圖5a-d)。免疫熒光染色顯示ZMYM 1的核定位及METTL3的缺失誘導(dǎo)BGC 823細(xì)胞ZMYM 1的表達(dá)損失,而過表達(dá)METTL 3則增加MKN-28細(xì)胞的ZMYM 1水平(圖5e)。qRT-PCR驗證了隊列1中ZMYM1的表達(dá)。 在這個樣本人群中,ZMYM1表達(dá)經(jīng)常在GC組織中升高,并與METTL3表達(dá)正相關(guān)(圖5f,g)。 通過共聚焦成像也證實了METTL3和ZMYM1在GC組織中的核共定位(圖5h)。數(shù)據(jù)表明,METTL 3正調(diào)控ZMYM 1在GC中的表達(dá)。


六、METTL 3通過m6A-Hur依賴途徑增強(qiáng)ZMYM 1 mRNA表達(dá)
   MERIP、qRT-PCR對m6A測序數(shù)據(jù)集進(jìn)行了驗證,結(jié)果抗m6A抗體顯著富集胃癌細(xì)胞中ZMYM1 mRNA水平的變化。METTL 3的敲除或過表達(dá)顯著降低或增加了ZMYM1 mRNA的m6A水平(圖6a,b)。突變體ZMYM 1的m6A修飾因m6A一致序列(RACH)中的胞嘧啶取代腺苷堿而被取消(圖6c)。熒光素酶報告試驗表明,野生型ZMYM 1的轉(zhuǎn)錄水平不高,突變體在沒有METTL 3的情況下顯著降低(圖6d)。METTL 3過表達(dá)增強(qiáng)了野生型ZMYM 1融合報告基因的表達(dá),顯示ZMYM 1水平的調(diào)控受METTL 3相關(guān)m6A修飾的控制(圖6e)。HuR結(jié)合位點(diǎn)位于ZMYM1的m6A修飾區(qū)域,這是由我們的m6A測序所揭示的(圖4f)。使用抗HuR抗體的RIP-qPCR顯示,在METTL3沉默的BGC823細(xì)胞中,HuR對ZMYM1 mRNA的親和力大大降低,而在MKN-28細(xì)胞中,METTL3的過表達(dá)則顯示出相反的結(jié)果(圖6f,g)。經(jīng)修飾的METTL 3表達(dá)后,所有GC細(xì)胞的Hur表達(dá)情況均無明顯變化(圖6~j)。揭示了METTL 3介導(dǎo)的m6A修飾通過m6A-Hur依賴性途徑增強(qiáng)ZMYM 1的表達(dá)。


七、ZMYM 1與核內(nèi)的CtBP/LSD 1/COREST復(fù)合物有物理聯(lián)系
   鋅指家族蛋白參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)控。我們將全長ZMYM 1融合到gal 4的DNA結(jié)合區(qū),并測試了其在GC細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果表明,標(biāo)記ZMYM1在BGC823和MKN-28細(xì)胞中均以劑量依賴性方式顯著抑制報告基因的活性(圖7a,b)。ZMYM1的過表達(dá)根本不影響Gal4驅(qū)動的報道分子的活性(圖7c),這表明ZMYM1與DNA物理結(jié)合,發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄抑制活性。IP用抗ZMYM1的抗體進(jìn)行IP免疫,然后用抗CtBP / LSD1 / CoREST復(fù)合物成分的抗體進(jìn)行免疫印跡,證明ZMYM1與所有測試的蛋白質(zhì)都有相互作用(圖7d,e)。相反,用抗CtBP1 / 2,LSD1或CoR EST抗體進(jìn)行IP免疫接種,然后用抗ZMYM1抗體進(jìn)行免疫印跡也證實ZMYM1被該復(fù)合物的所有組分有效地免疫共沉淀(圖7f)。結(jié)果表明ZMYM1在物理上與CtBP / LSD1 / CoREST復(fù)合體相關(guān)。

八、ZMYM 1相關(guān)復(fù)合物對E-鈣粘素的轉(zhuǎn)錄抑制作用
   實驗中,對CRS上所有復(fù)雜組分的富集進(jìn)行了驗證(圖7g)。此外,ZMYM1、CTBP1、LSD1和COREST的共同占有 在E-cadherin啟動子上,通過重新芯片分析(圖7H)確定了E-cadherin啟動子。為了進(jìn)一步證實ZMYM 1相關(guān)復(fù)合物對E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制作用,我們進(jìn)行了WB分析。 裂解并發(fā)現(xiàn)ZMYM1的增益-功能伴隨E-cadherin的降低表達(dá)。顯著地,在CTB中,ZMYM1過表達(dá)引起的E-cadherin的衰減被取消。 P1,LSD 1,或支柱被擊倒(圖7i)。數(shù)據(jù)表明,ZMYM 1通過與CtBP/LSD 1/Corest復(fù)合物結(jié)合,靶向和抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄。


九、METTL 3介導(dǎo)的ZMYM 1表觀遺傳激活與胃癌的EMT和轉(zhuǎn)移有關(guān)
   在MYTTL3敲低細(xì)胞中,ZMYM1表達(dá)的升高概括了N鈣粘蛋白和波形蛋白的水平,并降低了E鈣粘蛋白的表達(dá)(圖8a)。相反,抑制ZMYM1至少部分抵消了METTL3過表達(dá)引起的EMT進(jìn)程加速(圖8b)。 Transwell入侵試驗表明,敲低METTL3降低了GC細(xì)胞的侵襲能力,而ZMYM1的異位表達(dá)挽救了這種能力(圖8c,e)。相反,過表達(dá)METTL3可增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力,與sh-ZMYM1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染可部分減弱細(xì)胞侵襲能力(圖8d,f)。對于肺轉(zhuǎn)移模型,觀察到相似的結(jié)果。引入ZMYM1可以至少部分抵消METTL3敲低對轉(zhuǎn)移的抑制作用,而與METTL3過表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)移潛能的增加則可以通過ZMYM1的耗盡而部分減弱(圖8g,h)。此外,根據(jù)免疫組織化學(xué)結(jié)果,ZMYM1的蛋白水平隨著肺轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)的減少而降低,并因修飾的METTL3表達(dá)引起的更多的肺定植而被上調(diào)(圖8i,j)。表明ZMYM1的過表達(dá)與METTL3介導(dǎo)的EMT和轉(zhuǎn)移有關(guān)。


結(jié)論:
   m6A修飾在GC中的關(guān)鍵作用,并發(fā)現(xiàn)METTL3 / ZMYM1 / E-鈣粘蛋白信號傳導(dǎo)是針對GC的抗轉(zhuǎn)移策略的潛在治療靶標(biāo)。