LncRNA PVT1與食管腺癌的關(guān)系揭秘

   PVT1在許多腫瘤類型中已作為致癌基因出現(xiàn)。然而，其在Barrett食管（BE）和食管腺癌（EAC）中的作用尚不清楚。本研究的目的是評(píng)估PVT1在BE/EAC進(jìn)展中的作用，并揭示其對(duì)EAC的治療價(jià)值。本文通過qPCR檢測(cè)PVT1在正常、BE、EAC組織中的表達(dá)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以確定PVT1表達(dá)與EAC（分期、轉(zhuǎn)移、生存）的關(guān)系，并檢測(cè)PVT1反義寡核苷酸（ASOs）的體內(nèi)外抗腫瘤活性。

結(jié)果：
1.PVT1 lncRNA在EAC患者中的過表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)
   首先，利用TCGA數(shù)據(jù)集分析了多種癌癥類型的PVT1基因組改變，我們發(fā)現(xiàn)ESCA是第二大癌癥類型，存在20% PVT1擴(kuò)增，約75%的ESCA病例同時(shí)存在擴(kuò)增和重復(fù)（圖1a）。進(jìn)一步分析兩種主要的ESCA亞型EAC和ESCC，我們發(fā)現(xiàn)EAC患者具有相對(duì)較高的PVT1擴(kuò)增，其在西方人群中的發(fā)病率也較高，這使我們關(guān)注EAC（圖1b）。與ESCA中TCGA RNA Seq數(shù)據(jù)整合后，無論是復(fù)制還是擴(kuò)增，PVT1的遺傳改變與PVT1的表達(dá)水平顯著相關(guān)（圖1c），提示EC中PVT1的遺傳改變導(dǎo)致其mRNA水平上調(diào)。為了證實(shí)TCGA數(shù)據(jù)集的發(fā)現(xiàn)，接下來，我們用qPCR在我們自己的患者隊(duì)列中檢測(cè)PVT1 lncRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，PVT1 lncRNA的表達(dá)升高與BE的進(jìn)展存在顯著的相關(guān)性（圖1d）。而且MYC mRNA在EACs中也顯著升高（圖1e）。另外，我們發(fā)現(xiàn)PVT1表達(dá)與臨床特征顯著相關(guān)。如圖2a所示，PVT1高表達(dá)與高T期、高N期、腫瘤分級(jí)不良顯著相關(guān)。Kaplan-Meier分析顯示，與PVT1 lncRNA表達(dá)水平較低的EAC患者相比，PVT1 lncRNA表達(dá)水平較高的EAC患者總體生存期較短（圖2b）。

2.PVT1的抑制抑制了EAC細(xì)胞在體內(nèi)外的生長(zhǎng)
   通過qPCR檢測(cè)PVT1在正常食管上皮細(xì)胞系和4個(gè)EAC細(xì)胞系的表達(dá)。與HET-1A細(xì)胞系相比，EAC細(xì)胞系中PVT1 lncRNA水平明顯升高（圖3a）。隨后，我們?cè)u(píng)估了人類PVT1特異性ASOs，發(fā)現(xiàn)三種PVT1 ASOs （ASO 4、ASO 5和ASO 6）在EAC細(xì)胞系中以劑量依賴的方式有效抑制了PVT1的表達(dá)（圖3b）。為了進(jìn)一步闡明PVT1 ASOs對(duì)EAC細(xì)胞的抑制作用，我們?cè)贘HESO和OE19細(xì)胞中進(jìn)行了集落形成和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，與未處理或?qū)φ战M相比，PVT1 ASOs均可顯著抑制EAC細(xì)胞的集落形成，且呈劑量依賴性（圖3c）。同樣，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，PVT1 ASOs處理EAC細(xì)胞后，侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖3d）。為了進(jìn)一步研究PVT1 ASO抑制PVT1是否會(huì)影響體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，裸小鼠皮下注射JHESO細(xì)胞。小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和PVT1組。治療3周后觀察腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤體積。PVT1 ASO組腫瘤體積及重量較對(duì)照組明顯下降（圖3e）。此外，經(jīng)qPCR檢測(cè)，PVT1 ASO治療組腫瘤組織中PVT1的表達(dá)較對(duì)照組明顯下降（圖3f）。這些結(jié)果證實(shí)了PVT1 ASO對(duì)EAC的體外和體內(nèi)抑制作用。

3.PVT1 ASOs抑制EAC細(xì)胞的CSC特性
   為了評(píng)估PVT1對(duì)EAC細(xì)胞的CSC特性的影響，我們對(duì)暴露于PVT1 ASOs的JHESO和OE19細(xì)胞系進(jìn)行了腫瘤球?qū)嶒?yàn)。從圖4a和圖b可以看出，PVT1 ASOs處理后，與對(duì)照組ASO治療的EAC細(xì)胞相比，JHESO和OE19細(xì)胞中腫瘤球的形成均明顯減少。當(dāng)ASOs敲除PVT1后，ALDH1A1+細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖4c）。此外，ALDH1表達(dá)的減少與腫瘤球的大小和數(shù)量的顯著減少相一致。這些結(jié)果提示PVT1 lncRNA與EAC的CSC相關(guān)，可能在EAC的腫瘤發(fā)生/進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。

4.YAP1對(duì)EAC中PVT1的正反饋調(diào)節(jié)作用
   為了識(shí)別EAC中參與調(diào)控PVT1的分子通路，我們使用PVT1 ASO對(duì)未經(jīng)處理和處理的EAC細(xì)胞系進(jìn)行了多個(gè)信號(hào)通路的RPPA分析。結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，經(jīng)PVT1處理的細(xì)胞中YAP1的表達(dá)明顯下調(diào)；相反，磷酸化的YAP1增加（圖5a），表明YAP1是PVT1潛在的下游靶標(biāo)。接著通過qPCR進(jìn)一步證實(shí)了PVT1和YAP1表達(dá)之間的相關(guān)性，即PVT與YAP1表達(dá)顯著相關(guān)（圖5b）。Pearson相關(guān)分析表明，YAP1表達(dá)與PVT1呈正相關(guān)（圖5b）。為了進(jìn)一步證實(shí)PVT1與YAP1的正相關(guān)關(guān)系，我們以PVT1 ASOs為工具，測(cè)定EAC細(xì)胞系OE19和JHESO中PVT1被抑制后YAP1的變化。如圖5c所示，在兩個(gè)EAC細(xì)胞系中，控制YAP1磷酸化和降解的直接上游激酶磷酸化lats1在PVT1 ASO治療后呈劑量依賴性增加。與之相對(duì)應(yīng)，PVT1 ASO處理的JHESO和OE19細(xì)胞中，Ser 127磷酸化的YAP1也顯著升高，而YAP1的表達(dá)降低（圖5c）。免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)YAP1核表達(dá)顯著降低，而LATS1磷酸化增加（圖5d）。
   為了驗(yàn)證YAP1是否反過來影響PVT1的表達(dá)，我們?cè)赟KGT-4 EAC細(xì)胞中產(chǎn)生了可誘導(dǎo)的YAP1 cDNA表達(dá)。如圖5e所示，成功誘導(dǎo)YAP1可顯著增加PVT1表達(dá)，與YAP1水平升高及其下游靶點(diǎn)SOX9、CTGF相關(guān)；與此相反，通過CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在SKGT-4細(xì)胞中高效敲除YAP1，在兩個(gè)克?。╕AP1 KO1和YAP1 KO2）中顯著降低了PVT1的表達(dá)，這與YAP1蛋白和mRNA水平的降低有關(guān)（圖5f）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，PVT1和YAP1都是相關(guān)的，并相互積極調(diào)節(jié)，這可能為EAC的治療提供一種新的機(jī)制上的見解。

5.同時(shí)抑制PVT1和YAP1可增強(qiáng)EAC細(xì)胞的體內(nèi)外生長(zhǎng)抑制
   為了研究PVT1和YAP1聯(lián)合抑制是否具有更強(qiáng)的EAC抗腫瘤活性，我們利用PVT1和YAP1特異性ASOs進(jìn)行了體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。如圖6a所示，雖然單獨(dú)使用PVT1 ASO或YAP1 ASO均可顯著抑制PVT和YAP1的表達(dá)，但二者聯(lián)合使用ASOs時(shí)，二者均可同時(shí)抑制PVT和YAP1的表達(dá)。在功能上，當(dāng)用PVT1或YAP1 ASOs處理JHESO和OE19 EAC細(xì)胞時(shí)，ASO治療組的菌落形成數(shù)量和平均大小均顯著減少。此外，與單獨(dú)使用ASO治療的EAC細(xì)胞相比，聯(lián)合使用JHESO和OE19細(xì)胞的菌落更少（圖6b）。這些數(shù)據(jù)表明，阻斷PVT1和YAP1可在體外協(xié)同抑制EAC細(xì)胞生長(zhǎng)。
   為了評(píng)價(jià)其體內(nèi)抗腫瘤作用，我們?cè)贘HESO異種移植小鼠模型中單獨(dú)或聯(lián)合使用PVT1和YAP1特異性ASOs，檢測(cè)了PVT1和YAP1特異性ASOs的抗腫瘤作用。裸鼠皮下注射JHESO細(xì)胞后，隨機(jī)分為4組（分別用對(duì)照ASO、PVT1 ASO、YAP1 ASO和聯(lián)合ASO治療）。體內(nèi)異種移植實(shí)驗(yàn)表明，與單純使用ASO手術(shù)治療相比，同時(shí)使用兩種ASOs治療可顯著降低腫瘤生長(zhǎng)（圖6c-e），體重沒有明顯變化（圖6f）。綜上所述，這些結(jié)果表明在EAC細(xì)胞中存在著PVT1和YAP1的相互調(diào)控，同時(shí)抑制PVT1和YAP1比單獨(dú)抑制任何一個(gè)基因更能有效抑制EAC腫瘤的生長(zhǎng)。因此，利用特異性ASOs聯(lián)合抑制YAP1和PVT1為EAC提供了一種新的治療策略。

結(jié)論：
   PVT1對(duì)EAC具有侵襲性表型，是一個(gè)較差的預(yù)后因子。PVT1和YAP1聯(lián)合靶向治療提供了最高的治療指標(biāo)，代表了一種新的治療策略。