circRNA在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用,可作為疾病的生物標(biāo)志物。circRNA表達(dá)異常已在不同的病理過(guò)程中被發(fā)現(xiàn),包括肝癌、膀胱癌、肺癌和口腔癌的發(fā)病機(jī)制。已有報(bào)道m(xù)6A修飾廣泛存在于circRNA中。但m6A修飾對(duì)circRNA的影響與調(diào)控機(jī)制及其在腫瘤進(jìn)展中的生物學(xué)意義尚不清楚。Nature Communications雜志發(fā)表了一篇circRNA m6A修飾的文章“N6-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis”,文章報(bào)道發(fā)現(xiàn)m6A修飾的circNSUN2可結(jié)合YTHDC1并促進(jìn)其出核,進(jìn)一步結(jié)合IGF2BP2穩(wěn)定HMGA2 mRNA的穩(wěn)定性,從而促進(jìn)結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移。
結(jié)果:
1.circNSUN2的表達(dá)分析
我們使用兩對(duì)CRC和鄰近非腫瘤組織樣本進(jìn)行高通量circRNA微陣列。在這些基因組位點(diǎn)中,我們鑒定出38種調(diào)節(jié)異常的circRNA。其中,我們進(jìn)一步選取9個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且循環(huán)失調(diào)的環(huán)狀circRNAS作為候選(圖1a)。其中4種circRNA在超過(guò)75%的標(biāo)本中呈現(xiàn)出高表達(dá)的趨勢(shì)(圖1b)。另外,ircNSUN2高表達(dá)的組生存狀況顯著低于低表達(dá)組(圖1c)。而且與正常結(jié)直腸組織和腺瘤對(duì)照組相比,原發(fā)性CRCs中特別是LM的CRCs中circNSUN2表達(dá)顯著上升(圖1d)。此外,我們比較了從相同患者手術(shù)獲得的原發(fā)性CRCs (PC)和匹配的LM組織中circNSUN2的表達(dá),發(fā)現(xiàn)與原發(fā)性CRCs組織相比,在LM組織中circNSUN2的表達(dá)顯著增加(圖1e)。與對(duì)照組的CRCs患者相比,患有LM的CRCs患者的血清circNSUN2表達(dá)也顯著升高(圖1f)。
2.CRCs中circNSUN2的鑒定
我們通過(guò)RT-PCR、Sanger測(cè)序、RNase R處理和northern blot對(duì)HCT116細(xì)胞中的circNSUN2進(jìn)行分析。經(jīng)擴(kuò)增引物RT-PCR檢測(cè),序列產(chǎn)物與circNUSN序列一致(圖2a)。對(duì)RNase R外切酶的耐消化性證實(shí),該RNA物種具有環(huán)狀RNA結(jié)構(gòu)(圖2b)。然后,我們使用探針來(lái)區(qū)分circNSUN2及其宿主基因NSUN2(圖2c)。經(jīng)轉(zhuǎn)錄抑制劑actinomycin d處理后,qRT-PCR分析顯示,circNSUN2的半衰期超過(guò)24小時(shí),而相關(guān)線性轉(zhuǎn)錄物的半衰期約為4小時(shí)(圖2d),說(shuō)明circNSUN2在CRC細(xì)胞中更加穩(wěn)定。進(jìn)一步的核質(zhì)分離(圖2e)和熒光原位雜交(圖2f)檢測(cè)顯示,circNSUN2主要分布在胞質(zhì)中。這些結(jié)果共同揭示了circNSUN2是CRC中表達(dá)豐富而穩(wěn)定的circRNA。
3.circNSUN2促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移
鑒于circNSUN2在CRC侵襲性中的重要臨床意義,我們研究了circNSUN2在CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的體內(nèi)功能。結(jié)果表明,在PDX CRC細(xì)胞中,circNSUN2表達(dá)下調(diào)后,無(wú)論是在肝臟(圖3a)還是肺(圖3c)轉(zhuǎn)移模型中,腫瘤轉(zhuǎn)移均受到明顯抑制。相比之下,通過(guò)過(guò)度表達(dá)circNUSN2注入TC71細(xì)胞的裸小鼠與對(duì)照組相比,肝臟(圖3b)或肺(圖3d)的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)明顯增多。
4.YTHDC1促進(jìn)m6A修飾的circNSUN2的細(xì)胞質(zhì)輸出
為了探索circNSUN2調(diào)控CRC惡性腫瘤的潛在分子機(jī)制,我們首先進(jìn)行了RNA下拉實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析來(lái)篩選與circNSUN2相互作用的蛋白(圖4a)。我們驗(yàn)證了YTHDC1和IGF2BP2是推測(cè)的circNSUN2結(jié)合蛋白。進(jìn)一步的RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明,與對(duì)照相比,使用YTHDC1抗體沉淀的復(fù)合物中circNSUN2富集(圖4b)。由于YTHDC1是已知的m6A讀碼器,我們想知道circNSUN2是否含有m6A甲基化。通過(guò)甲基化RNA免疫沉淀分析,我們發(fā)現(xiàn)circNSUN2的外顯子5和外顯子4連接序列在m6A的析出分?jǐn)?shù)中得到了高度富集(圖4c),證實(shí)了circNSUN2中的m6A修飾。序列分析預(yù)測(cè)到了circNSUN2中存在GAACU motif,通過(guò)突變實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),當(dāng)RNA探針中GAACU m6A基序或YTHDC1的m6A結(jié)合基序發(fā)生突變,YTHDC1與circNSUN2的相互作用能力下降(圖4e)。此外,核質(zhì)分離(圖4f)和FISH(圖4g)表明,YTHDC1的沉默顯著增加了細(xì)胞核circRNA的含量。YTHDC1野生型(WT)的強(qiáng)迫表達(dá)挽救了circNSUN2的細(xì)胞質(zhì)輸出缺陷??傊@些結(jié)果證明YTHDC1可以與circNSUN2結(jié)合,從而促進(jìn)circNSUN2以m6A依賴(lài)的方式從 細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)輸出。
5.circNSUN2通過(guò)CAUCAU與IGF2BP2相互作用
從RNA下拉實(shí)驗(yàn)中,我們首先觀察到circNSUN2被大量的IGF2BP2蛋白下拉(圖5a),進(jìn)一步的RNA免疫沉淀證實(shí)了IGF2BP2與circNSUN2之間的相互作用(圖5b)。通過(guò)免疫熒光和熒光原位雜交檢測(cè),我們證實(shí)了胞質(zhì)中內(nèi)源性表達(dá)的circNSUN2和IGF2BP2的共域化(圖5c)。這些結(jié)果表明circNSUN2/IGF2BP2在細(xì)胞質(zhì)中形成了RNA蛋白復(fù)合物。另外,我們研究了IGF2BP2與circNSUN2相互作用的結(jié)構(gòu)域。RIP分析(圖5d)顯示,IGF2BP2的KH3-4-di-domain特異性地與circNSUN2結(jié)合。之前已報(bào)道IGF2BP2結(jié)合RNA的motif是CAUH (H = A、U或C),在circNSUN2中存在該基序,于是基于位點(diǎn)突變前后EMSA分析,我們驗(yàn)證了circNSUN2內(nèi)的CAUCAU是IGF2BP2相互作用所必需的(圖5e)。我們的數(shù)據(jù)揭示了IGF2BP2通過(guò)KH3-4–di-domain與circNSUN2的CAUCAU結(jié)合。
6.circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2復(fù)合物促進(jìn)HMGA2 mRNA穩(wěn)定
由于IGF2BP2對(duì)mRNA的穩(wěn)定性至關(guān)重要,我們接下來(lái)想知道circNSUN2/IGF2BP2復(fù)合物是否能穩(wěn)定某些未知的下游靶點(diǎn)。因此,我們?cè)O(shè)計(jì)了干擾circNSUN2前后分析轉(zhuǎn)錄組的差異情況,644個(gè)mRNA表達(dá)在circNSUN2沉默后顯著下降。據(jù)報(bào)道,IGF2BP2優(yōu)先與AU含量高的靶mRNAs的3’UTR結(jié)合。基于已發(fā)表的CLIP數(shù)據(jù)分析了這644種mRNA的情況,其中有21種mRNA可以結(jié)合IGF2BP2??紤]到circNSUN2促進(jìn)了轉(zhuǎn)移進(jìn)程,結(jié)合qRT-PCR和WB驗(yàn)證,我們證實(shí)了HMGA2是circNSUN2的靶點(diǎn)。RNA下拉實(shí)驗(yàn)證實(shí)了circNSUN2和HMGA2之間的相互作用(圖6a)。干擾circNSUN2后HMGA2的mRNA穩(wěn)定性顯著降低(圖6b)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、免疫熒光-FISH共定位分析和circNSUN干擾證明了circNSUN2在促進(jìn)IGF2BP2與HMGA2相互作用方面起著關(guān)鍵作用,并通過(guò)形成circNSUN2/ IGF2BP2/HMGA2 RNA蛋白三元復(fù)合物來(lái)提高HMGA2的 mRNA穩(wěn)定性(圖6c-f)。
7.circNSUN2通過(guò)HMGA2途徑促進(jìn)CRC肝轉(zhuǎn)移
我們研究circNSUN2在CRC轉(zhuǎn)移中的作用是否依賴(lài)于HMGA2。體內(nèi)模型表明,干擾circNSUN2可抑制肝轉(zhuǎn)移,但同時(shí)過(guò)表達(dá)HMGA2則促進(jìn)肝轉(zhuǎn)移(圖7a-e)。另外,為了揭示circNSUN2在CRC中的臨床相關(guān)性,我們檢測(cè)了97例CRC患者中circNSUN2和HMGA2的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)HMGA2的表達(dá)水平與circNSUN2的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)(圖7f)。接下來(lái)我們又檢測(cè)了20例CRC患者原發(fā)性和肝轉(zhuǎn)移組織中HMGA2的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,HMGA2的表達(dá)上調(diào)在肝轉(zhuǎn) 移中比在原發(fā)性組織中更為普遍(圖7g)。
結(jié)論:
circNSUN2與細(xì)胞核內(nèi)m6A結(jié)合蛋白YTHDC1結(jié)合,并且YTHDC1以m6A依賴(lài)的方式調(diào)控circNSUN2的出核定位。同時(shí)發(fā)現(xiàn)胞漿circNSUN2可與RNA結(jié)合蛋白IGF2BP2結(jié)合,并能直接結(jié)合下游HMGA2 mRNA,形成circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2 RNA-蛋白三元復(fù)合物,促進(jìn)HMGA2 mRNA穩(wěn)定性。進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)裸鼠轉(zhuǎn)移及體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn),證明了circNSUN2通過(guò)促進(jìn)HMGA2mRNA的穩(wěn)定性進(jìn)而最終促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤的肝轉(zhuǎn)移。