標書新亮點——鐵死亡
鐵死亡是一種調節(jié)性細胞死亡，其特征是致命脂質活性氧物質的鐵依賴性積累，有助于組織內環(huán)境穩(wěn)定和多種病理，可用于治療。然而，細胞對鐵死亡的敏感性不同，一個關鍵的挑戰(zhàn)是理解導致耐藥性的機制。2019年11月14日發(fā)表的新研究“Prominin2 Drives Ferroptosis Resistance by Stimulating Iron Export”，該文通過結合細胞外泌體深入研究，揭示了鐵死亡抗性可以由Prominin2-MVB-外泌體蛋白途徑驅動，并對鐵穩(wěn)態(tài)、細胞內轉運和癌癥具有廣泛的意義。
亮點:
1)前鐵感受器刺激誘導蛋白Prominin2的表達
2)Prominin2促進上皮細胞和癌細胞的鐵死亡抗性
3)Prominin2促進含有鐵蛋白的多泡體和外泌體的形成
4)鐵蛋白胞外運出細胞抑制鐵死亡
結果:
一、Prominin2由鐵依賴應力誘導并促進對鐵依賴細胞死亡的抗性
為了深入了解促進鐵死亡抗性的機制，采用核糖核酸測序法比較了粘附和細胞外基質分離的永生化乳腺上皮細胞中的基因表達。與貼壁細胞相比，PROM2編碼pentaspanin蛋白prominin2在細胞外基質分離細胞中的表達顯著增加。此外，它被認為在脂質動力學和膜組織中有作用，這些過程可能與鐵死亡抗性相關。經證實，在蛋白質和基因水平(圖1A和1B)。在分離的和粘附的Hs578t乳腺癌細胞(圖1B)。在MCF10A和Hs578t細胞中prominin2表達的沉默導致細胞外基質分離條件下生存力的顯著喪失(圖1B和1C)。通過與鐵死亡的特異性抑制因子ferrostatin-1，但不能與泛半胱天冬酶抑制劑ZVAD-fmk共同治療 (圖1C)。這些數(shù)據(jù)表明，在細胞外基質脫離后未能上調PROM2可能導致鐵死亡。
圖1Prominin2是一種鐵死亡應激反應蛋白
我們接下來研究GPX4的藥理學抑制是否改變了粘附細胞中的prominin2表達并影響了鐵死亡。MCF10A和Hs578t細胞用共價GPX4抑制劑RSL3處理2 h，導致兩種細胞系中prominin2 mRNA和蛋白質表達增加(圖1d和1E)。與MCF10A和Hs578t細胞不同，RSL3在另一種乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞(圖1d和1E)。prominin2表達的誘導與GPX4抑制誘導的對鐵死亡的抗性相關。在高達2.5微米的濃度下，MCF10A和Hs578t細胞對arsenic bloom誘導的細胞死亡具有抗性，而arsenic bloom濃度低至0.5微米(圖1f)。
對照MCF10A細胞比Hs578t細胞對這些化合物更具抗性(圖2A和2B)。與兩種細胞系的對照細胞相比，在prominin2敲除細胞中觀察到對所有四種化合物的敏感性顯著增加(圖2B)。 Ferrostatin-1完全彌補了Prominin2缺失細胞中細胞活力的喪失，這表明Prominin2沉默的細胞對敏感性的提高并不是由細胞死亡的另一種模式引起的(圖2C)。在MDA-MB-231細胞中，外源性Prominin2的表達足以抑制響應RSL3、ML210、FIN56和erastin (圖2D)。prominin2的表達促進了對鐵死亡的抗性。隨后的實驗使用RSL3作為原型GPX4抑制劑。
圖2 Prominin2增加對鐵死亡的抵抗力
二、Prominin2促進多囊體和外泌體的形成
為了深入了解prominin2如何促進鐵死亡抗性，我們評估了GPX4抑制后的亞細胞定位。免疫熒光顯微鏡顯示，prominin2定位于離散的細胞質點，以響應RSL3(圖3A)。在prominin2和TSG101(多囊體的標志)之間觀察到顯著的共定位 (圖3A)。早在GPX4被抑制后30分鐘，prominin2和TSG101的共定位就很明顯，這種共定位在核周區(qū)(圖3B)。在后期(1.5-2小時)，這種共定位在整個細胞質中是明顯的。
圖3 Prominin2在GPX4抑制作用下促進微血管生成
上述結果促使我們評估prominin2是否響應GPX4抑制作用促進MVB的形成。RSL3處理的MCF10A和Hs578t細胞比載體對照處理的細胞含有更多的TSG101陽性結構，表明GPX4抑制誘導MVB形成(圖3A、3B)。R使用透射電子顯微鏡（TEM）評估了這些結構的形成是否取決于prominin2。實際上，經RSL3處理的MCF10A細胞每個細胞所含的MVB比對照細胞要多得多，這在Prominin2沉默的細胞中未觀察到(圖3C)。免疫熒光顯示，與對照細胞相比，缺失prominin2的MCF10A和Hs578t細胞中TSG101陽性點減少(圖3D、3E)。相反，在MDA-MB-231細胞中外源性Prominin2的表達增加了TSG101陽性結構的數(shù)量，并且如上所述，降低了鐵死亡敏感性(圖3F)。與MVBs在鐵死亡抗性中的因果作用一致，TSG101表達的減少增加了MCF10A和Hs578t細胞對RSL3誘導的細胞死亡的敏感性(圖4A、4B）這一死亡是用ferrostatin-1(圖4C)。這些數(shù)據(jù)表明GPX4的抑制刺激prominin2的表達和prominin2依賴的MVB形成，這促進了鐵死亡抗性。
圖4逃避鐵死亡需要多泡體的形成
微血管中不同的ilv，與外泌體的大小一致(80納米) 在RSL3處理的細胞中(圖3C)。為了評估GPX4抑制對胞外泌體形成的影響，通過超速離心從對照(DMSO)和RSL3處理的MCF10A和Hs578t細胞中收集胞外泌體。GPX4的抑制增加了胞外泌體的形成，這可以從RSL3處理的細胞的胞外泌體制劑中存在大量蛋白質的事實來證明(圖4D)。相反，對照細胞中的胞外泌體蛋白在該實驗中沒有檢測到(數(shù)據(jù)未顯示)。通過免疫印跡分析顯示，這些外泌體含有prominin2、CD63和TSG101，是由prominin2依賴性MVB形成(圖4D)。通過使用鞘磷脂酶抑制劑GW4869，發(fā)現(xiàn)抑制胞外泌體釋放增加了對照MCF10A和Hs578t細胞對RSL3的敏感性，但它并不顯著影響缺失prominin2細胞(圖4E)。
三、MVB/外泌體鐵轉運有助于抗鐵死亡
鐵蛋白與prominin2共定位于RSL3處理的MCF10A和Hs578t細胞中，但不在載體對照(DMSO)處理的細胞(圖5A)。鑒定了從這些細胞中收獲的胞外泌體中的鐵蛋白(圖5B)。抑制GPX4后，MDA-MB-231細胞不增加鐵蛋白表達。與對照細胞相比，外源性prominin2的表達誘導了在RSL3處理中鐵蛋白定位的更點狀模式(圖5C)。
圖5 Prominin2和鐵蛋白有助于游離鐵的調節(jié)
鐵蛋白重鏈(FTH1)和輕鏈(FTL)MCF10A和Hs578t細胞中GPX4抑制引起的細胞死亡增加(圖5D、5E)。鐵死亡是由ferrostatin-1或鐵螯合劑去鐵胺(DFO)挽救的(圖5F)。當prominin2或FTH1和FTL都被沉默時，Three chlorinated silica處理后游離鐵濃度增加(圖6A、6B)。通過響應GPX4抑制的表達prominin2的MDA-MB-231細胞中的Prominin2表達阻止了在對照細胞中觀察到的響應RSL3的鐵的增加(圖6C)。此外，通過降低TSG101的表達來阻斷MVB途徑顯著增加GPX4抑制后細胞內游離鐵的濃度(圖6D)。這些結果表明阻斷MVB/外泌體介導的鐵蛋白輸出導致GPX4抑制時細胞內鐵的積累。
圖6 GPX4抑制會改變游離鐵濃度
四、細胞外基質分離細胞通過Prominin2介導的MVB/外泌體形成抵抗鐵死亡
鐵螯合劑去鐵胺拯救了細胞外基質分離的、Prominin2缺失的MCF10A和Hs578t細胞中的細胞死亡，這與鐵輸出促進細胞死亡的缺陷一致(圖7A)。與對照細胞相比，細胞外基質的分離增加了缺失prominin2中游離鐵的濃度，這種效應在分離后2 h最為明顯，這與鐵死亡的開始(圖7B)。與Three chlorinated silica處理的貼壁細胞相似，細胞外基質分離增加了微血管密度的頻率，這種增加依賴于Prominin2(圖7C)。外泌體釋放通過MVB與質膜的融合來指示(圖7C)。在細胞外基質分離的MCF10A和Hs578t細胞(圖7D)，類似于在粘附的、RSL3處理的細胞中觀察到的共定位(圖3A)。這些結果表明，生理性鐵中毒應激可以通過prominin2/MVB鐵輸出途徑得以逃避。
圖7脫離細胞外基質誘導Prominin2依賴性MVB形成挽救鐵死亡
結論：
Prominin2促進乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞的鐵下垂抗性。從機理上講，prominin2促進了含有鐵蛋白的多泡體(MVBs)和將鐵運出細胞的外體的形成，抑制了鐵死亡。這些發(fā)現(xiàn)揭示了鐵死亡抗性可以由Prominin2-MVB-外體蛋白途徑驅動，并對鐵穩(wěn)態(tài)、細胞內轉運和癌癥具有廣泛的意義。