乳腺癌中KLK6蛋白酶介導的生化途徑

   激肽釋放酶相關的肽酶6（KLK6）是一種絲氨酸蛋白酶，通常在乳腺組織中表達，在乳腺癌中受到異常調節(jié)。在生理水平上，KLK6發(fā)揮乳腺癌的抑制作用，而其異常的過表達（比正常水平高50倍以上）是一部分乳腺癌的特征，并與嚴重的聯(lián)合免疫缺陷小鼠的原發(fā)性乳腺腫瘤的加速生長有關。
主要結果如下：
1、實驗設計
   實驗設計中作者選擇了其本身不表達KLK6且重表達KLK6也不降低其它KLKs表達的細胞系MDA-MB-231為親本。C5為KLK6,C21與侵襲表型相關，可見KLK6對MDA-MB-231細胞致瘤表型呈現(xiàn)出劑量依賴性規(guī)律(圖1B–D)。尾靜脈實驗顯示，C5細胞向肺轉移的效率與PAR細胞相似，而C28細胞不轉移(圖1E)，KLK6影響乳腺癌細胞的肺部定值也表現(xiàn)出劑量依賴性。

                                   圖1 劑量依賴性的KLK6表達恢復降低了MDA-MB-231細胞的體內和體外外致瘤性

2、蛋白組學表達譜
   MDA-MB-231為親本（PAR），C5為KLK6高表達細胞系，C28為KLK6生理正常表達細胞系。C28的平均光譜計數(shù)為24.94，C5的平均光譜計數(shù)為16.54，PAR的平均光譜計數(shù)為20.56。從這三個樣本中共計鑒定出3639個蛋白質，而三個樣本共有的蛋白質為2449（圖2A, B）。三個樣本中蛋白質的數(shù)量分別為：PAR有3628個，C28有3312，C5有2731個。以95%的概率統(tǒng)計，共有1814個蛋白同時存在于三個樣本中（圖2C）。C5和C28中發(fā)現(xiàn)的蛋白相對于PAR的相對表達水平如圖2D所示，蛋白表達改變可以分為三個類別：與KLK6表達水平無關的蛋白；表達量呈KLK6濃度依賴性下降或上升的蛋白；表達受KLK6影響呈現(xiàn)鐘形表達的蛋白質。最后一類可以解釋為什么當在相對于過表達的生理水平上重新表達時，KLK6對MDA-MB-231表型產生不同的作用。蛋白質組學分析結果通過p53，p65，α-微管蛋白和消去蛋白的WB得到驗證（圖2E）。

                                           圖2 MDA-MB-231細胞的蛋白質組學特征

   然后，作者使用IPA分析了C5和PAR或C28和PAR之間差異倍數(shù)大于4倍的蛋白質以尋找在C5和C28細胞之間差異激活或失活的途徑（圖3）。

                                                    圖3 分子途徑

3、KLK6在生理水平上的重新表達降低了S100蛋白的表達
   S100A蛋白在C28細胞中表達下調，而在C5、S100A4和S100A11細胞中表達上調(圖4A)。S100蛋白相對于KLK6表達的鐘形表達模式可以解釋為什么C5細胞與C28相比具有向肺轉移的能力。對KLK6的表達與S100蛋白表達的相關性進行了臨床探索，生理性KLK6水平與S100A11和S100A14呈負相關（圖4B，C）。而在基底樣癌中，KLK6與S100A11和S100A2呈正相關（圖4B，C）。

                                             圖4 KLK6影響S100A蛋白的水平

4、生理水平的KLK6可誘導凋亡相關蛋白的表達
   C28細胞凋亡相關蛋白表達上調，C5細胞凋亡相關蛋白表達下調(圖5)。凋亡介導蛋白（例如CASP8和CASP7）在C28細胞中表達的增加可能是其致瘤性降低的原因。乳腺癌臨床數(shù)據(jù)集分析顯示，KLK6表達與BCL成員表達具有相關性(圖5)。

                                           圖5 KLK6影響與凋亡相關的基因

5、KLK6的重新表達降低了RAB蛋白的表達
   RABs是調節(jié)囊泡運輸和細胞內通訊的細胞內運輸?shù)鞍?。由于異常的轉運與細胞極性的喪失、增殖的增加、細胞的運動和侵襲有關，因此囊泡轉運對上皮細胞的癌變具有重要意義。MDA-MB-231中RABs的表達具有較高的異質性：部分RABs成員表達在C28中略有下降，在C5細胞中表下降顯著，而其他RABs成員在C5和C28細胞中均有升高(圖6)。RAB表達的變化表明C5和C28細胞中的小泡運輸重組，并且RAB在C5中顯著下調但在C28中幾乎保持不變（圖6中的陰影框），這可能與細胞的轉移能力和致瘤性有關。乳腺癌臨床數(shù)據(jù)集分析顯示，KLK6表達與RAB26、RAB17和RAB30呈負相關(圖6)。

                                            圖6 KLK6影響RAB蛋白的表達

6、KLK6與多種角蛋白協(xié)同表達
   角蛋白(KRTs)參與EMT，可能參與腫瘤的侵襲和轉移。作者發(fā)現(xiàn)C5和C28細胞中KRT8和KRT18的上調，這與恢復MDA-MB-231中KLK6表達后誘導的間質到上皮的轉變有關。此外，作者還發(fā)現(xiàn)KRT81在過表達KLK6的C5細胞中上調，在低表達KLK6的C28細胞中下調。 該發(fā)現(xiàn)的生理學意義尚不清楚，但可能表明KRT81促進腫瘤發(fā)生。 乳腺癌臨床數(shù)據(jù)分析表明，KRT表達與KLK6相關（正向或反向），包括KLK6和KRT18的反向相關。此外，作者還發(fā)現(xiàn)KLK6的重表達導致MDA-MB-231中核糖體蛋白水平降低，并引起了分泌金屬蛋白酶活性的變化。

7、生存分析
   使用兩個綜合評分分析，即KLK6 + S100B-S100A7和KLK6 + S100B-S100A14-S100A16，以預測乳腺癌患者的長期生存（圖7A，B）。對于KLK6 + S100B-S100A7而言，得分低的乳腺癌患者比得分較高的乳腺癌患者有更長的生存期。因此，可以利用這種評分模式尋找診斷應用的方法。

                                              圖7 總體生存(OS)評分
   綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)KLK6對乳腺原發(fā)腫瘤的生長和轉移具有濃度依賴性。具體來說，當KLK6的表達水平與正常乳腺細胞分泌的水平相當時，它可在體內抑制原發(fā)腫瘤的形成和肺轉移。另一方面，KLK6過表達是乳腺癌的一個亞型，它促進了體內原發(fā)性腫瘤的發(fā)生和肺轉移。此外，本文也是首次將KLK6的致瘤性與S100A和凋亡介導蛋白的表達聯(lián)系起來的研究。
參考文獻：
   Pampalakis Georgios., Zingkou Eleni., Sidiropoulos Konstantinos Gus., Diamandis Eleftherios P., Zoumpourlis Vassilis., Yousef George M., Sotiropoulou Georgia., (2019). Biochemical pathways mediated by KLK6 protease in breast cancer. Mol Oncol, 13, 2329-2343.