血清胞外小泡RNA測序的新視點

導語:
   細胞外囊泡（EVs）作為臨床相關生物標志物的來源具有巨大潛力，因為它們可以很容易地從生物流體中分離出來，并攜帶可反映疾病狀況的microRNA（miRNA），mRNA和蛋白質。但是，EV內含物的生物學和技術性可變性是未知的，這使得健康受試者與患者之間的比較難以解釋。在這項研究中，作者試圖建立一個實驗性和生物信息學分析渠道，以分析患者血清EVs中的小RNA含量，并評估健康個體中EVs的RNA含量的生物學和技術差異，說明這些小RNA可以用作生物標記。
技術路線:
1.細胞外囊泡的提取及其特征鑒定
2.對5個健康供體分離的EV進行了小RNA Seq以評估生物變異
3.對每個供體進行了5個重復的小RNA Seq，以評估技術變異
4.spikein分析揭示了Truseq方法的測序偏差
5.文庫的選擇影響RNAseq檢測的miRNA序列
研究結果:
   1.從5例健康供體的1毫升血清中分離出EV。透射電鏡顯示完整的圓形顆粒，顆粒一般小于200nm。用動態(tài)光散射法測定其粒徑分布，發(fā)現(xiàn)其峰值約為200nm左右。通過流式細胞術觀察到Annexin V和CD81的存在，但無法檢測到CD9或CD63的存在，且表明脂蛋白復合物出現(xiàn)的頻率較低。我們發(fā)現(xiàn)Alix存在于分離物中，而ApoB不存在。來自患者樣本的代表性電圖顯示了使用exoRNeasy試劑盒獲得的RNA的大小分布，這表明該方法產生了預期的RNA大小分布輪廓。

   
   2.為了解決EV小RNA Seq的技術和生物學變異，對從5個健康供體分離的EV進行了小RNA Seq，以評估生物變異，并對每個供體的5個重復進行了小RNA Seq，以評估技術變異。此外，在5個供體中加入了52個濃度為1X或2X的合成spikein，以評估文庫制備方法的敏感性和特異性。使用主成分分析評估數據集內數據可變性的來源。這種非監(jiān)督分析表明，給定供體的技術重復之間的差異遠遠小于個體間的差異。采用兩兩離散點圖來測量同一供體重復之間的技術方差，估計供體之間的技術方差平均為0.25%(0.10- 10 0.50%)。雖然個體間方差大于技術方差，但未超過健康受試者與類風濕關節(jié)炎(RA)患者之間的差異。表明該方法能夠識別健康人群與患者人群之間的差異。

   3. 摻有1X和2X數量的合成寡核苷酸的樣品用于評估文庫制備中的miRNA偏倚。每個樣品（1X或2X）被測序3次以創(chuàng)建總共6個文庫，每組三個樣品的平均值用于分析。具有1X和2X的樣品在所有方面都是相同的，除了摻入的濃度不同。我們通過繪制1x和2x樣品的已知輸入濃度與輸出讀數的關系圖，分析了52個刺入的讀數數，以評估文庫制備方法的完整性。我們在圖3（a）中顯示了1X的三個重復樣本的輸入尖峰濃度與RNA-Seq輸出讀數之間的相關性。在沒有偏見的情況下，我們預計輸入的刺入濃度與測序后的輸出刺入讀數數量相關（接近藍色所示的最佳擬合線）。但是，我們觀察到輸入濃度和輸出讀數之間的相關性很差（R2 = 0.30），表明該方法存在問題。對三個原始供體的一個子集進行了一項后續(xù)研究，每個供體包含三個技術重復（總共九個樣品），在其中添加了1倍的摻混混合物。然后使用Illumina Truseq小RNA方案或針對小RNA的Bioo Scientific Nextflex方案對9個樣品中的每一個進行測序。從第二個研究中獲得的加標讀物從所有文庫中提取出來，并通過方案與輸入濃度進行比較，結果表明Nextflex方案在整個輸入濃度范圍內具有線性范圍，總體相關性為0.67，而Truseq的相關性為0.33。此外，在Truseq和Nextflex方案之間，通過卡方檢驗（p值<0.0001），輸出讀數與輸入濃度之間的相關性在統(tǒng)計上有顯著差異。因此，Nextflex方案產生的結果更適合引入的尖峰濃度。

   4. 為了進一步評估Truseq和Nextflex文庫制備方法之間的差異，比較了每個協(xié)議生成的讀操作。由供體標記的校正數據集的主成分評分圖顯示，供體聚集的樣本符合預期。然而，kit的選擇也影響聚類，無論是生物方差還是kit的選擇有助于數據集的可變性。此外發(fā)現(xiàn)，與Truseq試劑盒相比，Nextflex試劑盒在供體中識別出了大約150多個獨特的mirna，。然而，Truseq方案比Nextflex方案產生了更大比例的miRNA，這一差異具有統(tǒng)計學意義，表明后者可能過度表達了某些miRNA序列而遺漏了其他miRNA，這與spikein分析一致。
   使用Truseq和Nextflex方法生成的數據集的技術差異非常小。但試劑盒之間的相關性較差，相關系數很少大于0.55。因此，不能直接比較不同協(xié)議生成的數據。對兩種文庫制備方案獲得的所有轉錄本進行了差異表達分析。差異表達分析顯示兩種方案之間有1075個轉錄本存在顯著差異?；鹕綀D的差異表達基因顯示大部分的顯著差異是基于>雙重的表情變化和p值小于0.05,與前100個差異表達基因的熱圖顯示這些記錄的表達水平差別很大。
   對10個差異表達的miRNA進行了定量PCR (qPCR)，其中包括前5位上調和前5位下調的miRNA。將qPCR數據轉化為miRNA豐度并與Truseq和Nextflex方法中相同miRNA的reads進行比較。所有基因在Nextflex協(xié)議中都有可檢測的讀計數，但在Truseq (log (TMM歸一化讀)>1)中只有5/10可檢測到。根據qPCR，未被Truseq方案檢測到的5個miRNA分子中，沒有一個是低豐度的，這與Truseq文庫制備方法存在方法學偏差一致，而不是較差的檢測下限。此外，還計算了qPCR和每個文庫制備試劑盒之間的Pearson相關性。Truseq和Nextflex的相關系數分別為0.05和0.1。因此，在這兩種庫準備方法中，Nextflex方法生成的數據更有可能反映mirna的表達水平。

總結: 
   使用Illumina Truseq方法對來自多個人的EV小RNA進行了測序（生物學重復），并每個人進行了多個重復的測序（技術重復）。我們觀察到受試者聚集樣本的重復數表明，生物變異(約95%)大于技術變異(約0.50%)。我們觀察到約30％的測序讀段是miRNA。我們通過將EV RNA制備物摻入合成的小RNA混合物來評估測序的技術參數，并證明了添加RNA的投入濃度和測序Read的頻率之間有脫節(jié)，這表明在文庫制備過程中引入了偏差。為了確定文庫制備平臺之間是否存在差異，我們將Truseq與Nextflex方法進行了比較，旨在減少文庫制備偏差。盡管這兩種方法在技術上都非?？煽?，但Nextflex方法降低了偏差，并且合成spike-ins的輸入濃度呈現(xiàn)出線性分布。總之，我們的結果表明，技術變異性遠小于生物學變異性，從而支持了將EV小RNA用作潛在的生物標記。我們的研究結果還表明，文庫制備方法的選擇導致數據的人為差異，從而導致通過文庫制備平臺的測序數據的可比性失效。