單細(xì)胞RNA測序揭示了人胚胎植入前后滋養(yǎng)細(xì)胞命運(yùn)分化的調(diào)控機(jī)制

   同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院聯(lián)合美國洛杉磯加州大學(xué)分校和吉安生殖醫(yī)學(xué)中心，2019年10月發(fā)表于國際雜志PLOS Biology的一篇研究“Single-cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism for trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses” (影響因子=8.386)，
   本實(shí)驗(yàn)?zāi)M了人類受孕期胚胎從囊胚到后期早期的發(fā)育過程，通過使用體外共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行Lantation階段，并從這些概念中分析476個個體滋養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄體。該研究揭示了調(diào)節(jié)周圍環(huán)境的遺傳網(wǎng)絡(luò)，胚胎滋養(yǎng)層發(fā)育。在確定滋養(yǎng)層細(xì)胞何時發(fā)生分化時，確定T-box轉(zhuǎn)錄因子3 (Tbx 3)是差異的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(CT)轉(zhuǎn)化為合體滋養(yǎng)細(xì)胞(ST)。通過功能缺失驗(yàn)證了TBX 3在滋養(yǎng)層分化中的作用。最后，該研究團(tuán)隊證明了為研究滋養(yǎng)細(xì)胞在著床前發(fā)育過程中的發(fā)育和分化規(guī)律提供了有價值的研究資源。
結(jié)果一、植入胚胎發(fā)育過程中人滋養(yǎng)層細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組譜
   將體外受精產(chǎn)生的概念培養(yǎng)到胚泡期。在胚泡期(第6.5天)，轉(zhuǎn)移到裝有人原代EM細(xì)胞的培養(yǎng)皿中。在第8天，所有共培養(yǎng)的概念動物都從透明帶中孵出，并附著在盤子的底部，并采用扁平結(jié)構(gòu)，與以前的報道非常相似(圖1B和1G)。

   為了獲得植入胚胎發(fā)育過程中人滋養(yǎng)層細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組譜，從第6天到第10天收獲了19個概念細(xì)胞的單細(xì)胞，并補(bǔ)充了25個EM細(xì)胞。成功地分析了614個單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，主成分分析(PCA)和無偏層次聚類表明概念EM細(xì)胞和EM細(xì)胞形成2個不同的簇(圖2A)，并且一些EM細(xì)胞在細(xì)胞挑選過程中被錯誤標(biāo)記為概念細(xì)胞(圖2B)。
使用300個譜系標(biāo)記的PCA分析顯示，EPI和PE細(xì)胞與TE譜系細(xì)胞分離(圖2C和2D)。此外，EPI和PE細(xì)胞與TE相比，其相應(yīng)的標(biāo)記基因表達(dá)更高(圖2E)，而特征良好的TE標(biāo)記(如GATA2和GATA3)在所有TE譜系細(xì)胞中均高表達(dá)(圖2F)。這些結(jié)果表明該算法忠實(shí)地將EPI和PE譜系細(xì)胞與TE譜系細(xì)胞分離。
  從第6天到第10天，發(fā)現(xiàn)5種TE標(biāo)記，即KRT19，KRT18，KRT8，GATA2和GATA3始終在TE和滋養(yǎng)細(xì)胞中高表達(dá)(圖2F和2H)。總的來說，單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)提供了從胚泡到植入后早期階段體外培養(yǎng)的人類概念中滋養(yǎng)細(xì)胞的全面轉(zhuǎn)錄組譜分析。

二、加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析表明植入后滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)育的遺傳程序動力學(xué)
   PCA顯示滋養(yǎng)層細(xì)胞按其發(fā)育日分組(圖2D)。為了系統(tǒng)地研究遺傳程序的動力學(xué)，對2,464個基因進(jìn)行了加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)，這些基因在不同發(fā)育階段的滋養(yǎng)層細(xì)胞中可變表達(dá)。WGCNA確定了8個基因模塊，每個模塊都包含一組在特定發(fā)育階段傾向于共表達(dá)的基因(圖3A)。通過將模塊表達(dá)與發(fā)育日聯(lián)系發(fā)現(xiàn)這8個模塊共同代表了3個遺傳網(wǎng)絡(luò)，這些網(wǎng)絡(luò)在第6天，第7-8天和第8-10天特別上調(diào)(圖3B)。GO術(shù)語(例如細(xì)胞遷移，細(xì)胞外基質(zhì)組織和對缺氧的反應(yīng))富含這些基因，表明激活了滋養(yǎng)細(xì)胞入侵(圖3C)。 為了進(jìn)一步鑒定可能在這3個遺傳網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的基因，基于WGCNA量模內(nèi)基因連通性鑒定了240個中樞基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)WGCNA集線器基因可能是早期胎盤發(fā)育的潛在關(guān)鍵調(diào)控基因。

三、單細(xì)胞RNA測序揭示了滋養(yǎng)細(xì)胞分化的時機(jī)
   滋養(yǎng)層亞系(例如EVT，CT和ST)衍生自多能滋養(yǎng)層。為了研究多能滋養(yǎng)細(xì)胞首次分化為滋養(yǎng)細(xì)胞亞系，使用了基于共享最近鄰(SNN)圖的聚類算法對476個滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行了無偏聚類，并將它們分為6個子種群(圖4A和4B)。通過檢查先前定義的亞譜系標(biāo)記基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EVT標(biāo)記(ITGA5，HLA-G，F(xiàn)N1，MMP2，CD9和ITGA1)或ST標(biāo)記(CGB5，PSG1，HSD3B1，CYP19A1，SDC1，INHA，ERVW- 1，ERVV-1和CGA在簇2或5中高度表達(dá)，而簇4共表達(dá)CT標(biāo)記(ITGA6，TP63，CTNNB1，LRP5，TEAD4，ELF5，F(xiàn)GFR2和FZD5)和EVT標(biāo)記基因相似到群集1(圖4C)。通過鑒定了在簇2、4和5中特異性表達(dá)的基因。發(fā)現(xiàn)許多ST標(biāo)記基因，例如HSD3B1，CYP19A1，SDC1，ERVW-1(Syncytin-1)，ERVV-1，CGA和CGB，在簇5中特異性高表達(dá)。CT標(biāo)志物，例如ITGA6和FZD5，在簇4中特異性表達(dá)。一些EVT標(biāo)志基因，例如MMP2，在簇2中特異性高表達(dá)(圖4D)。在第8天ST細(xì)胞變得更加豐富(168個細(xì)胞中的16個；圖4E)。免疫染色顯示，最早可在第7天檢測到hCGβ陽性細(xì)胞，并在第8天變得更為豐富(圖4F)。這些結(jié)果表明ST細(xì)胞首先在第7天后出現(xiàn)，并在第8天后變得更豐富。該研究發(fā)現(xiàn)EVT細(xì)胞在第7天的整個概念中都沒有，但在第8天出現(xiàn)，表明EVT在第7天后產(chǎn)生(圖4E)。結(jié)果揭示了ST和EVT在體外植入概念中出現(xiàn)的時間過程。

四、ST的開發(fā)需要TBX3
   通過使用完善的體外滋養(yǎng)細(xì)胞分化系統(tǒng) 驗(yàn)證TBX3在滋養(yǎng)細(xì)胞分化中的功能，該系統(tǒng)通過用單磷酸環(huán)腺苷(cAMP)類似物8-Br-處理滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞系JEG-3來模擬CT到ST分化。在未經(jīng)8-Br-cAMP處理的對照J(rèn)EG-3細(xì)胞中，細(xì)胞融合率低于1％，并且?guī)缀鯚o法檢測到ST標(biāo)記hCGβ表達(dá)，表明在處理之前ST的生成極少(圖5A和5B，0mM組)。與對照組相比，用8-Br cAMP處理48小時后，JEG-3細(xì)胞顯示出大大增強(qiáng)的細(xì)胞融合和hCGβ，融合率與8-Br-cAMP濃度相關(guān)(圖5A和5B)。值得注意的是，TBX3在對照組中未表達(dá)，但通過8-Br-cAMP處理顯著上調(diào)，并且上調(diào)倍數(shù)也與8-Br-cAMP濃度相關(guān)(圖5A和5C)。
   TBX3敲低還顯著減少了細(xì)胞融合(shTBX3-a和shTBX3-b細(xì)胞分別減少了75％±7％和64％±14％；圖5D)和下調(diào)的ST標(biāo)記轉(zhuǎn)錄，包括人絨毛膜促性腺激素亞基(CGA和CGB)，Syncytin(ERVW-1)和其他HERV衍生的基因(ERVV-1和ERVV-2；圖5E-5G。免疫染色顯示，通過TBX3敲低，hCGβ蛋白水平降低(圖5H)。綜上所述，TBX3是ST形成所必需的。

五、與EM細(xì)胞共培養(yǎng)會影響與滋養(yǎng)層發(fā)育相關(guān)的基因
   與EM細(xì)胞共培養(yǎng)7天細(xì)胞中有241個基因顯著上調(diào)，而共7天細(xì)胞中有140個基因顯著下調(diào)(Wilcox測試，調(diào)整后p <0.05)。 GO富集分析表明，在共7天的細(xì)胞中上調(diào)的基因與mRNA處理和翻譯等術(shù)語相關(guān)，而下調(diào)的基因與包括骨骼肌組織再生和上皮細(xì)胞成熟的術(shù)語相關(guān)。通過檢查DEG，發(fā)現(xiàn)與滋養(yǎng)細(xì)胞增殖，遷移和侵襲有關(guān)的基因——EIF5A。 WEE1，一種調(diào)控與滋養(yǎng)層細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)的有絲分裂的基因；這些結(jié)果表明與EM細(xì)胞共培養(yǎng)可以影響與滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因的表達(dá)。

六、轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示了極性TE標(biāo)記基因在植入后滋養(yǎng)層亞群中的表達(dá)模式
   使用129個先前鑒定的極性TE標(biāo)記進(jìn)行scRNA-seq數(shù)據(jù)分層聚類，將第7天的滋養(yǎng)細(xì)胞牢固地分為2個亞群，這與第7天存在的極性和壁厚TE一致(圖6A)。然后發(fā)現(xiàn)極性TE標(biāo)記在第6天和第7天非共培養(yǎng)的細(xì)胞中均低表達(dá)，在不同發(fā)育天的CT細(xì)胞中均中等表達(dá)。有趣的是，在包括EVT和ST在內(nèi)的分化的滋養(yǎng)細(xì)胞中，極性TE標(biāo)記顯著上調(diào)(圖6B)。

結(jié)論：
   該研究建立了植入后滋養(yǎng)層細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜，發(fā)現(xiàn)TBX3作為人類滋養(yǎng)細(xì)胞分化的“必需上游”調(diào)節(jié)劑，發(fā)揮了新的作用。 為后續(xù)的研究提供了獨(dú)特的資源，用于了解與早期滋養(yǎng)層缺陷相關(guān)的早期胎盤發(fā)育和發(fā)病機(jī)理。