快看過(guò)來(lái)：circRNA測(cè)序結(jié)合機(jī)制實(shí)驗(yàn)輕松發(fā)14分文章啦！

   越來(lái)越多的證據(jù)表明，單鏈環(huán)狀RNA（circRNA）在包括肝細(xì)胞癌（HCC）的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。但是，尚不清楚circRNA在HCC轉(zhuǎn)移中起何種作用。 在這項(xiàng)研究中，作者通過(guò)circRNA測(cè)序，確定了circASAP1，它與HCC患者根治性切除術(shù)后的肺轉(zhuǎn)移有關(guān)。本文于2019年12月發(fā)表在Hepatology (IF:14.971)。
結(jié)果如下：
1、鑒定circASAP1參與了HCC轉(zhuǎn)移和預(yù)后
   對(duì)15例有肺轉(zhuǎn)移和無(wú)肺轉(zhuǎn)移的組織進(jìn)行circRNA-seq，獲得其差異表達(dá)的circRNA聚類(lèi)熱圖和火山圖（圖1A-B）。其中最顯著上調(diào)的包括circASAP1，其來(lái)源如圖1C。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，三個(gè)circRNA中，只有circASAP1在轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系中顯著高表達(dá)，且高表達(dá)circASAP1患者的總體生存期更短，復(fù)發(fā)率更高?？傊Y(jié)果提示circASAP1參與了HCC轉(zhuǎn)移和預(yù)后。

2、CircASAP1促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移和進(jìn)展
   如圖2A-D所示，circASAP1過(guò)表達(dá)促進(jìn)了HepG2和PLC/PRF/5細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲。圖2E和F顯示，敲除circASAP1顯著降低了小鼠的肝腫瘤和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。以上說(shuō)明circASAP1促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。

3、CircASAP1海綿吸附miR-326和miR-532-5p
   作者采用RNA免疫沉淀法檢測(cè)circASAP1與AGO2的結(jié)合，結(jié)果顯示AGO2抗體可顯著富集circASAP1(圖3A)，說(shuō)明circASAP1被納入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中。使用circASAP1特異性探針進(jìn)行circRNA下拉實(shí)驗(yàn)，qRT-PCR檢測(cè)到18個(gè)miRNA的富集，其中miR-326和miR-532-5p的含量顯著高于其它miRNA(圖3B)。如圖3C和D所示，circASAP1和miR-326，miR-532-5p之前確實(shí)存在結(jié)合，以及共定位。以上證實(shí)，circASAP1可通過(guò)海綿吸附miR-326和miR-532-5p。

4、 CircASAP1通過(guò)海綿miR-326和miR-532-5p促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移和進(jìn)展
   作者實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-326或miR-532-5p可抑制HCCLM3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，干擾其表達(dá)則相反。此外，抑制miR-326或miR-532-5p表達(dá)可以減輕circASAP1敲除引起的HCCLM3細(xì)胞增殖、集落形成、遷移和侵襲能力下降(圖4B)，相反地，過(guò)表達(dá)miR-326或miR-532-5p則可廢止過(guò)表達(dá)circASAP1引起的生物學(xué)反應(yīng)(圖4A)。此外，小鼠體內(nèi)模型實(shí)驗(yàn)具有相似的結(jié)果(圖4C和4D)，提示circASAP1通過(guò)海綿miR-326和miR-532-5p促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。

5、在HCC細(xì)胞中circASAP1通過(guò)海綿吸附miR-326和miR-532-5p提高CSF-1和MAPK1的表達(dá)
   HCCLM3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-326或miR-532-5p均可顯著降低CSF-1和MAPK1的mRNA和蛋白水平（圖5A-D）。熒光素酶結(jié)果顯示，miR-326和miR-532-5p均可顯著抑制野生型3 -UTRs的CSF-1和MAPK1的熒光素酶活性，但對(duì)突變型則無(wú)影響(圖5E)。此外，在HCC樣本中，miR-326和miR-532-5p水平與CSF-1和MAPK1 mRNA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(圖5F)。綜上所述，在HCC細(xì)胞中，CSF-1和MAPK1是miR-326和miR-532-5p的直接靶點(diǎn)。
   之后作者研究了circASAP1是否調(diào)控CSF-1和MAPK1的表達(dá)。qRT-PCR、western blot、ELISA結(jié)果顯示，circASAP1過(guò)表達(dá)時(shí)，CSF-1、MAPK1表達(dá)升高，敲除circASAP1后，表達(dá)降低(圖5G、5H、5I)。此外，miR-326和/或miR-532-5p的過(guò)表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了circASAP1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的CSF-1分泌和MAPK1表達(dá)增加；類(lèi)似的，敲除miR-326和/或miR-532-5p則有相反的效果（圖5J）。在肝癌組織中CSF-1和MAPK1的mRNA表達(dá)水平與circASAP1水平呈正相關(guān)（圖5K）。以上結(jié)果表明，在HCC細(xì)胞中circASAP1通過(guò)海綿吸附miR-326和miR-532-5p來(lái)增強(qiáng)CSF-1和MAPK1的表達(dá)。

6、CircASAP1通過(guò)調(diào)控miR-326/miR-532-5p-MAPK1信號(hào)軸來(lái)促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和侵襲
   MAPK1又名ERK2，通過(guò)ERK1/2途徑發(fā)揮其功能，是眾所周知的腫瘤啟動(dòng)子在肝細(xì)胞癌中上調(diào)表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)ERK1/2抑制劑SCH772984在不影響總ERK1/2蛋白水平的情況下，以劑量依賴(lài)性的方式顯著降低ERK1/2磷酸化水平(圖6A)。此外，SCH772984能以劑量依賴(lài)的方式阻斷circASAP1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲(圖6B和C)。這些結(jié)果表明，circASAP1通過(guò)調(diào)控MAPK1的表達(dá)，影響ERK1/2信號(hào)通路，促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和侵襲。
   另一方面，作者發(fā)現(xiàn)circASAP1通過(guò)調(diào)節(jié)miR326/miR-532-5p-CSF-1信號(hào)來(lái)介導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)的浸潤(rùn)(圖6D和E)。circASAP1通過(guò)CM促進(jìn)了巨噬細(xì)胞從PLC/PRF/5細(xì)胞的增殖和遷移，下調(diào)則效果相反(圖6F和G)。小鼠模型試驗(yàn)顯示下調(diào)miR326/miR-532-5緩解了因異種移植中circASAP1基因敲除誘導(dǎo)的TAM浸潤(rùn)；而過(guò)表達(dá)miR-326/miR-532-5p可消除circASAP1誘導(dǎo)的F4/80+ TAMs在PLC/PRF/5異種移植物中的浸潤(rùn)(圖6H)。這些結(jié)果表明，circASAP1通過(guò)調(diào)控miR-326/miR-532-5p-CSF-1信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)TAM細(xì)胞的浸潤(rùn)。

7、CircASAP1、CSF-1、MAPK1、CD68+ TAMs對(duì)HCC患者有預(yù)后價(jià)值
   為了確定circASAP1、CSF-1、MAPK1和CD68+ TAMs在HCC中的臨床意義，作者使用380例HCC原發(fā)腫瘤組織的組織芯片檢測(cè)了這些因子的表達(dá)。圖7A是典型案例圖。circASAP1水平高的HCC腫瘤CSF-1和MAPK1表達(dá)水平高，TAM浸潤(rùn)增多（圖7B）。高circASAP1表達(dá)水平患者的1年、3年和5年生存率顯著低于circASAP1低表達(dá)水平患者，類(lèi)似的，circASAP1高表達(dá)水平患者預(yù)后差，復(fù)發(fā)率高（圖7C）?？傊?，circASAP1、CSF-1、MAPK1、CD68+ TAMs對(duì)HCC患者有預(yù)后價(jià)值。

   總之，本文所講述的故事如圖7D所示，CircASAP1在HCC中通常上調(diào)表達(dá)，circASAP1與miR-326/miR-532-5p結(jié)合，降低其豐度，進(jìn)一步抑制其靶基因CSF-1、MAPK1的表達(dá)，其中MAPK1通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路，促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和侵襲，CSF-1則促進(jìn)TAM細(xì)胞的浸潤(rùn)。
參考文獻(xiàn)：
   Hu Zhi-Qiang., Zhou Shao-Lai., Li Jia., Zhou Zheng-Jun., Wang Peng-Cheng., Xin Hao-Yang., Mao Li., Luo Chu-Bin., Yu Song-Yang., Huang Xiao-Wu., Cao Ya., Jia Fan., Zhou Jian., (2019). Circular RNA Sequencing Identifies CircASAP1 as a Key Regulator in Hepatocellular Carcinoma Metastasis., Hepatology, undefined, undefined.