外泌體與糖尿病傷口愈合

    目前，開發(fā)改善糖尿病個(gè)體傷口愈合的治療策略仍然具有挑戰(zhàn)性。外泌體代表了一種有前途的納米材料，可以從中分離出microRNA（miRNA）。這些miRNA具有發(fā)揮治療作用的潛力，因此，確定外泌體中循環(huán)的特定miRNA的潛在治療作用非常重要。在這里，小編與大家分享一篇近期發(fā)表于Small上的文章“Circulating Exosomal miR-20b-5p Inhibition Restores Wnt9b Signaling and Reverses Diabetes-Associated Impaired Wound Healing”。在本研究中，我們從2型糖尿病患者或健康對(duì)照組中分離出外泌體，并評(píng)估了其在糖尿病傷口愈合中的作用。

結(jié)果：
1.來(lái)自患有或不患有2型糖尿病的志愿者的外泌體特征
    我們首先通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM），動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和WB評(píng)估從志愿者患者血漿中分離的外泌體。DLS揭示了外泌體大小在30到200 nm之間，與先前有關(guān)外泌體大小的報(bào)道一致（圖1A）。透射電鏡顯示這些顆粒具有杯狀或球形的形態(tài)（圖1B）。[12] WB進(jìn)一步證實(shí)，這些顆粒包含外泌體表面標(biāo)記，例如CD81和TSG101（圖1C）。 這些結(jié)果一起證實(shí)了分離的循環(huán)納米顆粒是外泌體。

2.來(lái)自2型糖尿病患者的外泌體阻礙小鼠創(chuàng)面愈合
    我們探索了來(lái)自2型糖尿病患者的外泌體對(duì)傷口愈合能力的影響。我們觀察到注射糖尿病患者的外泌體時(shí)傷口閉合速率明顯降低（圖2A，B），與非糖尿病外泌體對(duì)照相比，治療后10天傷口部位的平均灌注單位（MPUs）比率更低（圖2C） 。 此外，我們量化了傷口部位的CD31表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了糖尿病患者的外泌體能夠抑制局部血管生成（圖2D）。 這些發(fā)現(xiàn)共同表明，糖尿病患者的外泌體能夠延遲體內(nèi)傷口愈合。

3.來(lái)自2型糖尿病患者的外泌體抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖和血管形成并促進(jìn)細(xì)胞凋亡
    我們通過(guò)用PKH26染料標(biāo)記外泌體并將其添加到HUVEC培養(yǎng)基中來(lái)評(píng)估HUVEC在體外吸收循環(huán)外泌體的能力。結(jié)果顯示，基于細(xì)胞中的紅色熒光染色，HUVECs能夠在12小時(shí)內(nèi)吸收非糖尿病和糖尿病患者的外泌體（圖3A）。接下來(lái)，我們使用CCK-8和EDU摻入法評(píng)估了HUVEC增殖，從而探討了糖尿病患者的外泌體對(duì)HUVEC功能的影響。 我們發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于非糖尿病患者的外泌體治療，用50-100μg mL-1糖尿病患者的外泌體治療HUVEC足以以劑量依賴性方式顯著降低HUVEC增殖（圖3B，C）。 我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者的外泌體治療的HUVEC中，與增殖相關(guān)的蛋白Cyclin D1和Cyclin D3減少了（圖3D，E）。 流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步定量處理細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和凋亡率，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的外泌體處理后進(jìn)入S期的細(xì)胞比例明顯下降，而HUVEC凋亡相應(yīng)增加（圖3F，G）。 此外，我們觀察到糖尿病患者的外泌體治療后Bcl-2表達(dá)降低，而Bax表達(dá)升高（圖3H，I）。最后，我們探索了糖尿病外泌體調(diào)節(jié)HUVEC血管生成的能力，并發(fā)現(xiàn)糖尿病患者的外泌體治療后管形成顯著減少（圖3J，K）。 總之，這些發(fā)現(xiàn)表明來(lái)自2型糖尿病患者的外泌體會(huì)損害體外傷口的愈合。

4.2型糖尿病外泌體含有高水平的miR-20b-5p并將此miRNA轉(zhuǎn)移到HUVECs
    在先前的研究中，已發(fā)現(xiàn)miR-20b-5p在2型糖尿病患者的外泌體中高表達(dá)，同樣，我們證實(shí)了與非糖尿病對(duì)照組相比，糖尿病患者的外泌體中該miRNA的水平升高（圖4A ）。 迄今為止，我們已經(jīng)表明糖尿病患者的外泌體可以被HUVEC吸收，接下來(lái)我們?cè)u(píng)估包裹在這些外泌體中的miRNA是否可以被類似地吸收并在HUVEC中保持功能。與這種功能一致，我們發(fā)現(xiàn)相對(duì)于非糖尿病患者的外泌體治療的HUVEC，miR-20b-5p水平在糖尿病患者的外泌體治療的HUVEC中有顯著增加（圖4B）。為了探索miR-20b-5p介導(dǎo)糖尿病患者的外泌體對(duì)HUVEC功能的影響，我們用miR-20b-5p抑制劑（antagomiR-20b-5p）轉(zhuǎn)染了這些外泌體處理的細(xì)胞，結(jié)果顯示antagomiR-20b-5p轉(zhuǎn)染后miR-20b-5p表達(dá)下降（圖4C）。 CCK8和EDU分析證實(shí)，如果還用antagomiR-20b-5p處理，則用糖尿病患者的外泌體處理的細(xì)胞的增殖也會(huì)增強(qiáng)（圖4D，E）。 AntagomiR-20b-5p轉(zhuǎn)染還導(dǎo)致Cyclin D1和Cyclin D3表達(dá)增加，以及在S期的HUVEC百分比更高（圖4F，H）。我們同樣證實(shí)了antagomiR-20b-5p處理降低了糖尿病患者的外泌體誘導(dǎo)的HUVEC凋亡的能力（圖4K），并且在antagomiR-20b-5p處理的細(xì)胞中，血管的形成活性也得到了類似的增強(qiáng)（圖4L，N）?？傊@些結(jié)果表明，糖尿病患者的外泌體中富含miR-20b-5p，可以調(diào)節(jié)HUVEC功能。

5.miR-20b-5p抑制HUVECs的血管生成作用
    我們探索了miR-20b-5p通過(guò)使用agomiR或agomiR-20b-5p處理細(xì)胞而直接影響HUVEC的能力，后者顯著提高了miR-20b-5p的表達(dá)（圖5A）。 處理后，CCK8和EDU結(jié)果證實(shí)了miR-20b-5p抑制HUVEC增殖（圖5B，C）并降低細(xì)胞周期蛋白D1和D3表達(dá)的能力（圖5D，E）。 經(jīng)agomiR-20b-5p處理后，HUVECs更多地處于G1期和凋亡（圖5F，G），而用該miRNA轉(zhuǎn)染后，Bax表達(dá)增加而Bcl-2表達(dá)降低（圖5H，I）。 同樣，miR-20b-5p抑制了HUVEC管的形成（圖5J L）。這些結(jié)果證實(shí)了miR-20b-5p在體外直接抑制HUVEC功能的能力。

6.miR-20b-5p發(fā)揮抗血管新生的影響通過(guò)抑制Wnt9b /β-Catenin通路
    我們?cè)u(píng)估了miR-20b-5p抑制HUVEC功能的分子機(jī)制。為此，我們?cè)噲D使用miRbase，Targetscan和miRanda鑒定推定的miR-20b-5p靶標(biāo)，從而使我們將Wnt9b鑒定為值得驗(yàn)證的靶標(biāo)基因。如圖6A所示，鑒定出73個(gè)基因?yàn)閙iR-20b-5p靶基因。先前的研究報(bào)道血管生成與wnt /β-catenin信號(hào)通路密切相關(guān)。在仔細(xì)篩選了73個(gè)基因后，我們發(fā)現(xiàn)Wnt9b可能是參與miR-20b-5p介導(dǎo)的血管生成的最有潛力的基因。此外，我們發(fā)現(xiàn)miR-20b-5p過(guò)表達(dá)顯著抑制Wnt9b的表達(dá)的（圖6B）。我們通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-20b-5p能夠特異性結(jié)合到Wnt9b mRNA的預(yù)測(cè)靶區(qū)。當(dāng)這個(gè)靶區(qū)發(fā)生突變時(shí)，miRNA不再能夠結(jié)合抑制熒光素酶活性（圖6C）。為了證實(shí)HUVEC血管生成依賴于Wnt9b，我們使用針對(duì)Wnt9b的siRNA轉(zhuǎn)染HUVECs。該siRNA顯著降低了處理過(guò)的細(xì)胞中Wnt9b和β-catenin的表達(dá)（圖6D），抑制了細(xì)胞增殖和管形成，同時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞凋亡（圖6E-I）。抑制miR-20b-5p活性部分逆轉(zhuǎn)了siRNA-Wnt9b對(duì)HUVECs的抗血管生成作用。這些發(fā)現(xiàn)支持miR-20b-5p直接靶向Wnt9b的能力，從而抑制HUVEC的血管生成，因此表明該miRNA至少部分地通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt9b/β-catenin 信號(hào)通路起作用。

7.miR-20b-5p在體內(nèi)延遲傷口愈合
    最后，我們?cè)?、3、5、7、9和11天局部注射PBS、agomiR-20b-5p或antagomiR-20b-5p來(lái)評(píng)估m(xù)iR-20b-5p抑制體內(nèi)傷口愈合的能力。我們發(fā)現(xiàn)局部的agomiR-20b-5p注射顯著損害了傷口的愈合，局部MPU比值降低與miRNA延遲傷口修復(fù)的能力一致。 為了進(jìn)一步探索這種miRNA如何影響傷口愈合，我們?cè)赪T或miR-20b KO糖尿病模型小鼠的背部產(chǎn)生了傷口，并在miR-20b KO糖尿病小鼠中觀察到了優(yōu)異的傷口愈合（圖7A-E）。因此這些發(fā)現(xiàn)表明miR-20b-5p沉默能促進(jìn)傷口愈合，從而突出其作為糖尿病個(gè)體治療靶點(diǎn)的潛力。

結(jié)論：
    我們的體外和體內(nèi)研究結(jié)果均表明，糖尿病患者血漿外泌體通過(guò)在體外和體內(nèi)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成活性來(lái)抑制皮膚傷口愈合。miR-20b-5p在外泌體中的富集通過(guò)抑制Wnt9b /β-catenin信號(hào)通路在損害傷口愈合中起重要作用。 因此，將納米材料與miR-20b-5p抑制劑結(jié)合使用可能是將來(lái)促進(jìn)糖尿病傷口愈合的有前途的治療方法。