p53抑制腫瘤發(fā)生的奧秘

    腫瘤抑制因子p53轉(zhuǎn)錄激活靶基因，在應(yīng)激狀態(tài)下抑制細(xì)胞增殖。p53也與原癌基因Myc的抑制有關(guān)，但機(jī)制尚不清楚。因此，小編和大家分享一篇近期發(fā)表于molecular cell上的文章“p53 Activates the Long Noncoding RNA Pvt1b to Inhibit Myc and Suppress Tumorigenesis”。在這里，我們確定了Pvt1b，一種lncRNA Pvt1的p53依賴性亞型，表達(dá)了Myc下游的50kb，它是由DNA損傷或致癌信號(hào)引起的，并在其轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)附近積累。我們研究表明，在不改變基因座染色質(zhì)組織的情況下，Pvt1b RNA的產(chǎn)生對于抑制順式Myc轉(zhuǎn)錄是必要且充分的。抑制Pvt1b增加Myc水平和轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖。此外，在肺癌小鼠模型中，Pvt1b缺失加速了腫瘤生長。這些研究結(jié)果表明，Pvt1b在p53和Myc轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的交叉點(diǎn)發(fā)揮作用，增強(qiáng)p53的抗增殖活性。

結(jié)果：
1.p53在基因毒性和致癌應(yīng)激條件下抑制Myc
    為了深入了解p53抑制Myc的機(jī)制，我們模擬p53依賴的應(yīng)激反應(yīng)。為了模擬細(xì)胞對基因毒性應(yīng)激的反應(yīng)，我們使用野生型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs)，用基因毒性藥物Doxo處理（圖1A）。我們觀察到，在Doxo處理24小時(shí)后，p53轉(zhuǎn)錄程序的激活導(dǎo)致p21的3倍誘導(dǎo)，同時(shí)Myc RNA和蛋白水平降低（圖1B，C）。我們還發(fā)現(xiàn)，在小鼠肺腺癌細(xì)胞系中，p53激活是由腫瘤基因應(yīng)激，以他莫西芬-CreER依賴性恢復(fù)內(nèi)源性p53表達(dá)為模型的，同樣導(dǎo)致p21的激活和Myc RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的下降（圖1D-F）。在暴露于輻照6 Gy的腸道上皮細(xì)胞中，Myc抑制率為39%±5%（圖1G-H）。接著為了闡明p53激活導(dǎo)致Myc抑制的機(jī)制，我們檢查了p53是否與Myc位點(diǎn)相關(guān)。我們觀察到，在Doxo處理的MEFs和tamo處理的KPR細(xì)胞中，應(yīng)力依賴性的Myc抑制伴隨著p53與位于Myc下游50 kb處的遠(yuǎn)端p53RE的結(jié)合（圖1I）。與p53依賴相一致，p53存在的MEFs中，Myc RNA和蛋白水平的變化是存在的（圖1J，1K）。此外，Myc RNA水平的降低在p53激活4h后可以檢測到，與Myc蛋白水平的減少相吻合（圖1L和1M）。使用Cycloheximide抑制蛋白翻譯表明，壓力的存在并未顯著影響Myc蛋白的穩(wěn)定性（圖1N）。

2.Myc抑制與Pvt1b的激活相關(guān)
    考慮到lncRNAs可以順式調(diào)控鄰近基因的轉(zhuǎn)錄，我們檢測了Pvt1是否在脅迫時(shí)起到了限制Myc表達(dá)的作用（圖2A）。我們觀察到經(jīng)Doxo處理的MEFs中Pvt1b的誘導(dǎo)率為3.1±0.2倍（圖2B），經(jīng)Tam處理的KPR細(xì)胞中Pvt1b的誘導(dǎo)率為38±6倍(圖2C)。為了進(jìn)一步鑒定Pvt1位點(diǎn)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本，我們使用位于1a或1b外顯子的正向引物和位于5外顯子的反向引物進(jìn)行RT-PCR。我們發(fā)現(xiàn)了廣泛的選擇性剪接的證據(jù)，證實(shí)了含有外顯子1b的突變是由p53誘導(dǎo)的，而含有外顯子1a的突變是組成性表達(dá)的（圖2D和2E）。盡管存在剪接異質(zhì)性，但初期RNA測序顯示，僅通過使用外顯子1b和外顯子1a，應(yīng)力誘導(dǎo)的Pvt1b與本構(gòu)性表達(dá)的Pvt1a有所不同，并表現(xiàn)出與下游外顯子類似的剪接模式（圖2F）。

3.Pvt1b在Pvt1-Myc位點(diǎn)周圍的染色質(zhì)中積累
    為了深入了解Pvt1b的潛在調(diào)控功能，我們進(jìn)行了單分子RNA熒光原位雜交。我們觀察到Pvt1a和Pvt1b在依托泊苷（Etop）處理的MEFs中主要表現(xiàn)為2點(diǎn)或4點(diǎn)核模式，分別反映了細(xì)胞周期的G1期或S/ G2期（圖3A）。Pvt1a和Pvt1b在經(jīng)Tam處理的KPR細(xì)胞中形成較大的云團(tuán)（圖3B）。值得注意的是，含有Pvt1a和Pvt1b的位點(diǎn)與新生Myc內(nèi)含子特異性信號(hào)共定位，也與新生的Pvt1轉(zhuǎn)錄本共定位（圖3C-3F）。這些結(jié)果使我們得出結(jié)論，轉(zhuǎn)錄后，Pvt1a和Pvt1b保留在圍繞Pvt1-Myc位點(diǎn)的染色質(zhì)上。亞細(xì)胞分餾分析證實(shí)了這兩種Pvt1變體在染色質(zhì)組分中均有富集（圖3G）。

4.Pvt1b RNA抑制了Myc水平
    基于Pvt1b的應(yīng)力依賴性表達(dá)及其局部染色質(zhì)積累，我們推測Pvt1b可能通過RNA依賴性機(jī)制參與Myc的抑制。為了直接驗(yàn)證這一假設(shè)，我們設(shè)計(jì)了三個(gè)針對1b外顯子的獨(dú)立反義寡核苷酸（ASOs）（圖4A）。我們使用無目標(biāo)的ASO作為陰性對照。由于ASOs會(huì)導(dǎo)致共轉(zhuǎn)錄RNA的裂解和降解，ASO1、ASO2和ASO3會(huì)顯著下調(diào)Pvt1a和Pvt1b（圖4B）。接下來，我們研究了Pvt1靶向ASOs對Myc表達(dá)水平的影響。在未處理的MEFs中，與CON樣本相比，在ASO病例中，Myc RNA和蛋白水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化， （圖4C，4D）。與預(yù)期一樣，使用Doxo治療后，對照的MEFs的Myc RNA和蛋白水平顯著下降。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)以pvt1為靶點(diǎn)的ASOs完全挽救了應(yīng)力誘導(dǎo)的Myc RNA和蛋白的下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明，p53對Pvt1b的轉(zhuǎn)錄激活是Myc在應(yīng)激狀態(tài)下抑制的必要條件。為了檢測Pvt1b是否能充分抑制Myc，我們使用CRISPR-SAM系統(tǒng)激活p53缺陷細(xì)胞內(nèi)源性Pvt1b的表達(dá)。我們分別設(shè)計(jì)了針對Pvt1a和Pvt1b啟動(dòng)子的A1和A2 dRNA-MS2（圖4E）。與非靶向?qū)φ障啾?，使用A1的CRISPRa在不改變Pvt1b水平的情況下誘導(dǎo)了1.6倍的Pvt1a，而使用A2導(dǎo)致了20倍的Pvt1b活化（圖4F）。接下來，我們檢測了內(nèi)源性Pvt1a和Pvt1b的激活對Myc水平的影響。p53修復(fù)后，Pvt1b的激活并沒有進(jìn)一步下調(diào)Myc水平，這說明Pvt1b的作用是在p53的下游（圖4G）。另一方面，Pvt1b的激活不足以抑制Myc蛋白水平，這為在轉(zhuǎn)錄后水平獨(dú)立輸入Pvt1b提供了可能（4H）。然后，為了區(qū)分順式和反式的活性，我們通過轉(zhuǎn)染含有外顯子1a-10（1a）或1b-10（1b）的cDNA構(gòu)建物來檢測外源性的Pvt1a和Pvt1b是否會(huì)影響Myc的表達(dá)（圖4I）。我們觀察到Pvt1a的過表達(dá)為6.5倍，而Pvt1b的過表達(dá)為23倍，與CRISPRa誘導(dǎo)的過表達(dá)相當(dāng)（圖4J）。然而，我們發(fā)現(xiàn)外源運(yùn)輸?shù)腜vt1a或Pvt1b對Myc RNA或蛋白水平?jīng)]有顯著影響，這與反式運(yùn)輸?shù)挠绊懴喾矗▓D4K、4L）。

5.Pvt1b的遺傳抑制逆轉(zhuǎn)應(yīng)力誘導(dǎo)的Myc下調(diào)
    為了研究Pvt1b對p53抑癌途徑的功能貢獻(xiàn)，我們開發(fā)了一種基因方法，通過改變表達(dá)所需的p53RE來特異性抑制Pvt1b的表達(dá)。我們通過Sanger測序證實(shí)了p53RE的突變，并通過染色質(zhì)免疫沉淀證實(shí)了?RE突變將p53的結(jié)合降低了15倍（圖5A，5B）。通過qRT-PCR，與對照組相比，?RE細(xì)胞中的Pvt1b水平被顯著抑制（圖5C），而通過smRNA-FISH，我們觀察到經(jīng)Tam處理的?RE KPR細(xì)胞中Pvt1b特異性信號(hào)的丟失（圖5D，5E）。這些觀察使我們得出結(jié)論，Pvt1b相關(guān)的p53RE突變導(dǎo)致了應(yīng)力依賴性Pvt1b活化的有效消除。接下來，我們通過qRT-PCR和免疫印跡法檢測了?RE突變以及由此導(dǎo)致的Pvt1b表達(dá)缺失對細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中Myc水平的影響。在Con KPR群體、KPR克隆和MEF系中，暴露于致癌或基因毒性應(yīng)激導(dǎo)致的Myc RNA和蛋白水平預(yù)期顯著下降（圖5F-H）。與非應(yīng)激細(xì)胞相比，?RE KPR群體、KPR克隆和MEF系暴露于應(yīng)激并不導(dǎo)致Myc RNA水平顯著下降，這與ASO數(shù)據(jù)一致。這些結(jié)果為Pvt1b調(diào)控p53下游的Myc RNA水平提供了獨(dú)立的遺傳驗(yàn)證。

6.Pvt1b抑制了Myc轉(zhuǎn)錄活性和細(xì)胞體外增殖
    通過分析?RE突變對未處理、Doxo處理的?RE和Con MEFs的總RNA的基因表達(dá)的影響，我們證實(shí)Myc是Pvt1b應(yīng)對應(yīng)激的調(diào)控靶點(diǎn)（圖6A）。接下來，為了測試Pvt1b是否在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用，我們對未處理和經(jīng)Tam處理的?RE和Con KPR細(xì)胞新生RNA進(jìn)行了測序。我們發(fā)現(xiàn)，與Con+Tam KPR細(xì)胞相比，?RE+Tam細(xì)胞中新生的Myc轉(zhuǎn)錄本顯著上調(diào)（圖6B，6C）。這些數(shù)據(jù)表明，Pvt1b的產(chǎn)生促進(jìn)了Myc的轉(zhuǎn)錄抑制。接下來，我們通過檢測196個(gè)Myc靶基因中Pvt1b缺失的后果，探討Myc RNA水平的變化如何影響Myc轉(zhuǎn)錄程序。與隨機(jī)產(chǎn)生的一組表達(dá)水平相當(dāng)?shù)膶φ栈蛳啾?，我們發(fā)現(xiàn)MEFs和KPR細(xì)胞中Myc靶點(diǎn)的水平顯著升高（圖6D，6E）?？紤]到Myc靶基因包含促進(jìn)細(xì)胞生長的因子，我們將突變細(xì)胞的增殖與對照組進(jìn)行了比較。與對照組相比，Pvt1b表達(dá)的丟失導(dǎo)致細(xì)胞增殖和集落形成顯著增加（圖6F，6G）。這些數(shù)據(jù)表明，Pvt1b通過介導(dǎo)p53功能的特異性來抑制細(xì)胞的體外增殖。

7.Pvt1b的腫瘤特異性抑制促進(jìn)了體內(nèi)的腫瘤生長
    為了闡明Pvt1b是否在體內(nèi)介導(dǎo)p53功能的某些方面，我們對Pvt1b相關(guān)的p53RE進(jìn)行了腫瘤特異性誘變（圖7A）。Sanger測序證實(shí)了在UGPC-?RE感染動(dòng)物中成功突變了pvt1b相關(guān)的p53RE（圖7B）。接下來，我們檢查了感染UGPC-Con、UGPC-p53KO和UGPC-?RE病毒的小鼠肺部的HE切片，并在腫瘤發(fā)生16周后處死。組織病理學(xué)分析顯示，在感染UGPC-Con的動(dòng)物中，所有的腫瘤都表現(xiàn)出了1級(jí)特征。相比之下，70%的表達(dá)UGPC-p53KO的腫瘤以非典型核、間質(zhì)增生和向低分化表型轉(zhuǎn)化為特征，并被劃分為2級(jí)或3級(jí)（圖7C，7D）。另一方面，腫瘤面積相對于總肺面積的定量顯示，UGPC-?RE小鼠的腫瘤負(fù)荷較對照組小鼠顯著增加（圖7 E）。值得注意的是，p53RE編輯的小鼠的腫瘤負(fù)荷與UGPC-p53KO小鼠的腫瘤負(fù)荷相當(dāng)（圖7E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，Pvt1b在很大程度上介導(dǎo)了p53下游的生長抑制功能，尤其是在疾病的癌前病變階段。與UGPC-Con小鼠相比，感染UGPC-?RE的動(dòng)物的腫瘤負(fù)荷增加并不是由于細(xì)胞凋亡減少。相反，腫瘤負(fù)荷的增加可能是由于增殖的增強(qiáng)。在Pvt1b缺陷腫瘤中，來自UGPC-?RE感染動(dòng)物的腫瘤的磷酸化組蛋白H3 陽性的有絲分裂細(xì)胞明顯多于來自UGPC-Con感染小鼠的腫瘤（圖7F，7G）。最后，為了研究Pvt1b是下游作用還是獨(dú)立于p53，我們進(jìn)行了上位實(shí)驗(yàn)。我們分析了UGPC-Con或UGPC-?RE病毒在腫瘤發(fā)生12周后的腫瘤負(fù)荷。與上述結(jié)果一致，我們觀察到UGPC-?RE感染小鼠與UGPC-Con感染的KC動(dòng)物相比，腫瘤負(fù)荷顯著增加。相反，我們發(fā)現(xiàn)感染UGPC-?RE和UGPC-Con的KPC動(dòng)物的腫瘤負(fù)荷沒有顯著差異。感染UGPC-?RE的KC小鼠與感染UGPC-Con的KPC小鼠的腫瘤負(fù)荷差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7H）。這些結(jié)果表明，Pvt1b和p53通過一個(gè)共同 的途徑增強(qiáng)了癌前腫瘤的擴(kuò)散。

結(jié)論：
    保守的lncRNA亞型Pvt1b是一種位點(diǎn)特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在p53介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)中抑制Myc的轉(zhuǎn)錄。Pvt1b RNA的產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖和腫瘤生長，揭示了這種癌癥相關(guān)的lncRNA的腫瘤抑制活性。