MIR516A依賴自噬促進(jìn)膀胱癌的發(fā)展

    盡管MIR516A被報(bào)道在多種腫瘤中被下調(diào)并起到抑癌作用，但它的表達(dá)及其對(duì)膀胱癌（BC）的潛在作用尚不清楚。小編為大家介紹最近發(fā)表于“Autophagy”上的文章“Oncogenic role of MIR516A in human bladder cancer was mediated by its attenuating PHLPP2 expression and BECN1-dependent autophagy”。

    我們發(fā)現(xiàn)MIR516A在人BC組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào)，而MIR516A表達(dá)的抑制減弱了BC細(xì)胞體外單層生長(zhǎng)和體內(nèi)異種移植瘤生長(zhǎng)，并伴隨著PHLPP2的表達(dá)增加。進(jìn)一步的研究表明，MIR516A能夠直接與PHLPP2 mRNA的3’-非翻譯區(qū)結(jié)合。PHLPP2在MIR516A抑制細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)可能逆轉(zhuǎn)BC細(xì)胞的生長(zhǎng)，提示PHLPP2是MIR516A下游的一個(gè)介導(dǎo)因子，可能參與MIR516A的致癌作用。PHLPP2能間接介導(dǎo)BECN1/Beclin1的穩(wěn)定，從而促進(jìn)BECN1依賴性的自噬，抑制BC腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，通過(guò)減弱MIR516A而增加的自噬導(dǎo)致了體內(nèi)異種移植瘤形成的顯著抑制。
結(jié)果：
1.MIR516A是BC細(xì)胞體外和體內(nèi)生長(zhǎng)必需的
    為了檢測(cè)MIR516A在人BCs中的表達(dá)模式，我們采用定量PCR方法分析了MIR516A在新鮮臨床BC組織中的表達(dá)。如圖1A所示，MIR516A在BC組織中的表達(dá)顯著高于配對(duì)的鄰近非腫瘤組織。此外，我們還觀察到MIR516A在人膀胱癌細(xì)胞系（TCCSUP、UMUC3、J82和RT112）中的過(guò)度表達(dá)，與在人永生正常尿上皮細(xì)胞系UROtsa中的表達(dá)相比（圖1B）。為了確定MIR516A的上調(diào)是否在人BC的生長(zhǎng)中起作用，我們將MIR516A海綿抑制劑（MIR516Ai）質(zhì)粒穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到兩個(gè)BC細(xì)胞系UMUC3和J82中。結(jié)果表明，海綿抑制劑結(jié)構(gòu)顯著降低MIR516A水平（圖1C）。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，MIR516A的抑制作用顯著地降低了UMUC3和J82細(xì)胞的單層生長(zhǎng)（圖1D，E），表明MIR516A促進(jìn)了BC細(xì)胞的生長(zhǎng)。軟瓊脂試驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制MIR516A也會(huì)損害UMUC3和J82細(xì)胞的錨定獨(dú)立生長(zhǎng)（圖1F，G）。這些結(jié)果提示MIR516A不僅在人BCs中高表達(dá)，而且在BC細(xì)胞的生長(zhǎng)中起致癌作用。除體外實(shí)驗(yàn)外，我們還評(píng)估了MIR516A對(duì)裸鼠移植瘤模型中J82和UMUC3細(xì)胞致瘤性的影響。結(jié)果表明，抑制MIR516A的表達(dá)也能抑制裸鼠移植瘤細(xì)胞株UMUC3的生長(zhǎng)（圖1H），UMUC3-MIR516A I組移植瘤的重量明顯低于UMUC3載體對(duì)照組。MIR516A對(duì)J82細(xì)胞轉(zhuǎn)染的異種移植BC細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用也一樣（圖1H，I）。

2.MIR516A與PHLPP2 mRNA的3’ -UTR結(jié)合并下調(diào)其在人BC細(xì)胞中的蛋白表達(dá)
    為了闡明MIR516A促進(jìn)BC細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制，我們利用TargetScan 7.2軟件對(duì)MIR516A可能的靶向候選基因進(jìn)行了分析。綜合分析結(jié)果顯示，在ACTG2、ETS2和PHLPP2 mRNA的3’-UTR中可能存在MIR516A的結(jié)合位點(diǎn)，如圖2A所示。為了鑒定MIR516A調(diào)控功能的相關(guān)基因，我們檢測(cè)了相應(yīng)蛋白在UMUC3和J82細(xì)胞系中的表達(dá)。如圖2B所示，MIR516Ai對(duì)PHLPP2上調(diào)，ACTG2下調(diào)的抑制作用，對(duì)UMUC3和J82細(xì)胞中ETS2的表達(dá)沒(méi)有影響。鑒于PHLPP2是一種特性良好的腫瘤抑制因子，我們穩(wěn)定地將HA-PHLPP2轉(zhuǎn)染到UMUC3細(xì)胞中，并且PHLPP2的異位表達(dá)顯著抑制了UMUC3細(xì)胞的錨定獨(dú)立生長(zhǎng)（圖2C，D）。為了進(jìn)一步探討MIR516A調(diào)控PHLPP2表達(dá)的機(jī)制，我們構(gòu)建了PHLPP2 mRNA 3’ -UTR熒光素酶報(bào)告子的野生型和突變型（MIR516A結(jié)合位點(diǎn)突變），如圖2A所示。對(duì)熒光素酶活性的評(píng)估表明，與載體對(duì)照轉(zhuǎn)染物相比，其抑制劑對(duì)MIR516A的抑制提高了PHLPP2 mRNA 3’ -UTR熒光素酶活性（圖2E，F(xiàn)）。MIR516A結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)突變完全消除了MIR516A抑制劑對(duì)UMUC3和J82細(xì)胞誘導(dǎo)PHLPP2 mRNA 3?-UTR熒光素酶活性的影響（圖2E，F(xiàn)）。為了進(jìn)一步研究MIR516A調(diào)控PHLPP2的分子機(jī)制，我們通過(guò)實(shí)時(shí)PCR測(cè)定了其mRNA水平（圖2G）。結(jié)果導(dǎo)致我們排除了MIR516A在RNA降解水平上影響PHLPP2表達(dá)的可能性，因?yàn)镸IR516A不影響PHLPP2 mRNA的表達(dá)（圖2G）。因此，我們預(yù)期MIR516A通過(guò)抑制其蛋白翻譯而下調(diào)PHLPP2。為了確定PHLPP2是否是MIR516A在MIR516Ai對(duì)BC細(xì)胞錨定依賴性生長(zhǎng)影響中的下游介質(zhì)，通過(guò)轉(zhuǎn)染針對(duì)不同PHLPP2序列的shRNAs，降低了PHLPP2在UMUC3-MIR516Ai細(xì)胞中的表達(dá)。PHLPP2基因敲除增加UMUC3-MIR516A I細(xì)胞的錨定獨(dú)立生長(zhǎng)（圖2H，I），提示PHLPP2是MIR516A的直接下游靶點(diǎn)，MIR516A誘導(dǎo)的PHLPP2基因下調(diào)在MIR516A促進(jìn)BC細(xì)胞生長(zhǎng)中起作用。

3.MIR516A對(duì)人BC細(xì)胞自噬誘導(dǎo)和錨定非依賴性生長(zhǎng)的抑制作用
    為了探討MIR516A在人BC生長(zhǎng)調(diào)控中的作用機(jī)制，我們將MIR516Ai細(xì)胞的自噬狀態(tài)與對(duì)照載體細(xì)胞進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，MIR516A i對(duì)MIR516A的抑制作用可誘導(dǎo)UMUC3和J82 BC細(xì)胞的自噬（圖3A）。這一觀點(diǎn)得到了LC3點(diǎn)的形成（圖3B-D）和MIR516Ai-BC轉(zhuǎn)染體中觀察到的自溶體（圖3E，F(xiàn)）的支持。MIR516Ai細(xì)胞中PHLPP2基因敲除顯著降低自噬水平（圖3G-I）。為了確定自噬誘導(dǎo)在MIR516Ai誘導(dǎo)的BC細(xì)胞生長(zhǎng)抑制中的作用，采用自噬通量溶酶體抑制劑bafilomycin A1（BAF）。BAF對(duì)自噬的破壞明顯累積了LC3-II水平（圖3K），并逆轉(zhuǎn)了對(duì)UMUC3-MIR516Ai和J82-MIR516Ai細(xì)胞錨定獨(dú)立生長(zhǎng)的抑制（圖3L，M）。這些結(jié)果表明MIR516A抑制人BC細(xì)胞自噬，進(jìn)一步介導(dǎo)其促進(jìn)BC細(xì)胞生長(zhǎng)。

4.BECN1的抑制介導(dǎo)MIR516A對(duì)人BC細(xì)胞自噬的抑制
    為了闡明MIR516A介導(dǎo)的自噬抑制機(jī)制，我們研究了MIR516Ai對(duì)ATG蛋白的潛在作用。MIR516Ai的過(guò)度表達(dá)特異性上調(diào)了BECN1，對(duì)BC細(xì)胞中的其他自噬蛋白沒(méi)有類似的影響（圖4A，B）。與無(wú)義轉(zhuǎn)染物相比，在UMUC3細(xì)胞和UMUC3-MIR516Ai轉(zhuǎn)染物中PHLPP2的敲除始終減弱BECN1的表達(dá)（圖4C）。這些結(jié)果表明，MIR516A對(duì)BECN1有抑制作用，BECN1的抑制作用可能與MIR516A在人BC細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)有關(guān)。通過(guò)western blotting對(duì)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體進(jìn)行鑒定，并進(jìn)一步探索。BECN1過(guò)度表達(dá)顯著增加了LC3從LC3-I到LC3-II的轉(zhuǎn)化率（圖4D）。BECN1過(guò)表達(dá)也抑制了細(xì)胞的錨定獨(dú)立生長(zhǎng)（圖4E，F(xiàn)）。接下來(lái)，使用靶向人BECN1的shRNAs來(lái)抑制內(nèi)源性BECN1在J82-MIR516Ai細(xì)胞中的表達(dá)（圖4G）。結(jié)果表明，BECN1表達(dá)的敲除降低了LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化、斑點(diǎn)的形成和自溶體的形成（圖4H-J），表明BECN1確實(shí)在人BC細(xì)胞MIR516Ai異位表達(dá)誘導(dǎo)的自噬中起作用。如圖4K，L所示，BECN1基因敲除也挽救了J82-MIR516Ai細(xì)胞的錨定獨(dú)立生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，MIR516A抑制導(dǎo)致BECN1誘導(dǎo)，介導(dǎo)自噬，進(jìn)而抑制人BC細(xì)胞的錨定獨(dú)立生長(zhǎng)。

5.MIR516A-PHLPP2級(jí)聯(lián)促進(jìn)cul4a介導(dǎo)的BECN1蛋白降解
    BECN1在酵母中也稱為ATG6，是自噬起始和其他生物過(guò)程的關(guān)鍵蛋白。作為評(píng)估PHLPP2基因敲除細(xì)胞中BECN1下調(diào)機(jī)制的先決條件，首先用qRT-PCR檢測(cè)BECN1的mRNA水平。如圖5A所示，PHLPP2基因敲除對(duì)MIR516Ai表達(dá)細(xì)胞中的BECN1 mRNA水平?jīng)]有影響，表明MIR516A-PHLPP2軸不調(diào)節(jié)BECN1轉(zhuǎn)錄或mRNA穩(wěn)定性。因此，我們研究了MIR516Ai對(duì)BECN1蛋白降解的潛在影響。與對(duì)照UMUC3-MIR516Ai無(wú)義細(xì)胞相比，PHLPP2基因敲除增加了BECN1蛋白降解率（圖5B-D）。為了進(jìn)一步研究PHLPP2介導(dǎo)的抑制BECN1蛋白降解的分子機(jī)制，我們進(jìn)行共免疫沉淀和質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析結(jié)果表明，PHLPP2可能不會(huì)直接與BECN1相互作用和影響B(tài)ECN1。然而，經(jīng)過(guò)對(duì)免疫沉淀蛋白候選物的仔細(xì)研究和初步驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)E3泛素蛋白連接酶的幾個(gè)核心組分，包括CUL3、CUL4A和CUL4B，在我們的系統(tǒng)中顯示出更高的肽譜匹配值（圖5E）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MIR516A及其下游PHLPP2對(duì)BECN1的影響是否真的依賴于CUL4B、CUL4A或CUL3，我們首先檢測(cè)了這些蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。如圖5F所示，MIR516A-PHLPP2級(jí)聯(lián)可以調(diào)節(jié)CUL4A，但對(duì)CUL3和CUL4B的表達(dá)沒(méi)有明顯影響，提示CUL4A可能是PHLPP2抑制BECN1蛋白降解的關(guān)鍵因素（圖5G）。此外，異位CUL4A表達(dá)顯著促進(jìn)BECN1蛋白降解，而CUL4A基因敲除顯著降低BECN1蛋白降解（圖5I-J）。這些結(jié)果表明MIR516A-PHLPP2級(jí)聯(lián)主要通過(guò)CUL4A依賴機(jī)制促進(jìn)BECN1蛋白降解。

6.抑制MIR516A增加體內(nèi)移植瘤中PHLPP2和BECN1的表達(dá)并下調(diào)MKI67的表達(dá)
    為了確定MIR516A是否在體內(nèi)對(duì)PHLPP2和BECN1起下調(diào)作用，我們用IHC評(píng)估了J82-MIR516Ai異種移植瘤中PHLPP2和BECN1的表達(dá)，并與J82載體異種移植瘤進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，與注射J82載體細(xì)胞產(chǎn)生的異種移植瘤相比，J82-MIR516Ai異種移植瘤中這些蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)（圖6A-C）。PHLPP2的表達(dá)與裸鼠MIR516A抑制組織中BECN1的表達(dá)呈正相關(guān)（圖6E）。我們還確定MKI67/Ki-67是腫瘤細(xì)胞增殖的生物標(biāo)志物。如圖6A、C所示，在MIR516A抑制劑異種移植裸鼠組織中，MKI67陽(yáng)性BC細(xì)胞持續(xù)減少?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明MIR516A通過(guò)結(jié)合PHLPP2 mRNA的3’-UTR上調(diào)PHLPP2，導(dǎo)致CUL4A介導(dǎo)的BECN1蛋白降解減少，進(jìn)一步增加BECN1介導(dǎo)的自噬，從而抑制BC生長(zhǎng)（圖6F）。

結(jié)論：
    綜上所述，目前的研究結(jié)果確定了一個(gè)新的MIR516APHLPP2-CUL4A-BECN1自噬途徑參與MIR516A促進(jìn)BC的體內(nèi)外生長(zhǎng)。我們發(fā)現(xiàn)MIR516A通過(guò)直接結(jié)合其mRNA的3’-UTR而下調(diào)PHLPP2蛋白，而下調(diào)的PHLPP2通過(guò)促進(jìn)BECN1蛋白降解進(jìn)一步降低BECN1的表達(dá)，從而抑制自噬，促進(jìn)人BC細(xì)胞的生長(zhǎng)。