基金又一新方向———細胞焦亡的抑制

    細胞焦亡（pyroptosis）是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞程序性死亡方式，表現(xiàn)為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致細胞內(nèi)容物的釋放進而激活強烈的炎癥反應(yīng)。細胞焦亡是機體重要天然免疫反應(yīng)，在拮抗感染和內(nèi)源危險信號中發(fā)揮重要作用。相比于細胞凋亡（apoptosis），細胞焦亡發(fā)生的更快，并會伴隨大量促炎癥因子的釋放。2020年 03 月20日，  Muendlein HI,   Jetton D,   Connolly WM,  等人，在Science上發(fā)表了一篇關(guān)于cFLIP抑制細胞焦亡的機制文章“cFLIP protects macrophages from LPS-induced pyroptosis via inhibition of complex II formation”。

    細胞死亡和炎癥是宿主對感染的相互依賴的反應(yīng)。 在焦細胞凋亡期間，白細胞介素1b（IL-1b）的釋放通過caspase-1和caspase-11介導的Gasdermin D孔形成。 在體內(nèi)，對脂多糖（LPS）的反應(yīng)導致IL-1b分泌。 然而，在體外，鼠巨噬細胞需要炎性體驅(qū)動的IL-1b成熟的第二個“危險信號”。 最近的報道顯示，在LPS活化的巨噬細胞中caspase-8介導的細胞凋亡，但在這些條件下有關(guān)IL-1b釋放的證據(jù)相互矛盾。 在這里，為了進一步表征LPS誘導的體外分泌機制，作者揭示了細胞FLICE樣抑制蛋白（cFLIP）在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中的重要作用。
1.TAK1抑制之前的LPS啟動
    LPS驅(qū)動的死亡需要CASP8和GSDMD，但不需要NLRP3，CASP1或CASP11。 這表明cFLIP L缺乏癥在LPS激活后嚴格促進焦磷酸化。 cFLIP L KD消除了抑制TAK1誘導發(fā)燒的要求。 cFLIP L的沉默概括了TAK1抑制作用（通過YopJ或5z7處理），暗示cFLIP L是響應(yīng)LPS的主要細胞凋亡調(diào)節(jié)因子之一。

                                     圖1. TAK1抑制之前的LPS啟動引發(fā)IL-1b釋放，抑制細胞死亡并調(diào)節(jié)cFLIP水平。
    （A）BMDM中B6，無RIP1激酶失活（RIP1Ki），Trif-/-，Rip3-/-Casp8-/-和Gsdmd-/-的小鼠在LPS / 5z7處理下的細胞死亡。 （B）在指定治療后6小時，IL-1b從B6 BMDM中釋放。 LPS預(yù)灌注（10或100 ng / ml）分別在添加5z7或尼日靈之前4小時進行。 （C）與LPS / 5z7或LPS-pre-primed / 5z7同時刺激的B6 BMDM中的細胞死亡。 （D）在B6 BMDM中，LPS，LPS / 5z7或LPS預(yù)涂底漆/ 5z7處理1小時后，相對于Cflar mRNA水平標準化為Gapdh（磷酸甘油醛磷酸脫氫酶）。 R.U.，相對單位。 （E）cFLIP，GSMDD的全長（FL）和裂解產(chǎn)物，以及從LPS / 5z7或LPS–預(yù)處理的B6 BMDM的全細胞裂解液（WCL）或從上清液（Sup。）沉淀的胱天蛋白酶。 （F）B6 BMDM中的cFLIP蛋白水平被cFLIP L或cFLIP R擊倒或用非靶向（NT）對照轉(zhuǎn)導。（G）B6 BMDM中被cFLIP L或cFLIP R擊倒并被刺激的細胞死亡[在（F）中顯示的敲低程度]。來自細胞死亡測定和免疫印跡的數(shù)據(jù)代表了三個或更多獨立實驗，并且細胞死亡數(shù)據(jù)表示為一式三份孔的平均值±SD。 IL-1b釋放數(shù)據(jù)表示為來自三個或更多獨立實驗的一式三份孔的平均值±SD。使用方差分析（ANOVA）用于組間比較。
2.cFLIP L是響應(yīng)LPS的細胞凋亡的主要調(diào)節(jié)劑之一
    細胞死亡需要受體相互作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（RIP1）和GSMDD的激酶活性，但伴隨著低的IL-1b水平，這可能是由于抑制了MAPK和NF-kB介導的前IL- 1b生產(chǎn)。與同時用LPS和5z7處理的細胞相比，在5z7處理之前用LPS預(yù)灌注的骨髓衍生巨噬細胞（BMDM）產(chǎn)生的IL-1b水平明顯更高。

                                        圖2. LPS在不存在cFLIP L的情況下誘導caspase-8介導的細胞凋亡。
    （A）B6，Trif-/-和RIP1Ki BMDM中的細胞死亡被cFLIP L擊倒并受到刺激。 （B）用LPS或LPS / 5z7刺激長達1小時30分鐘的B6和B6 cFLIP L -KD BMDM中PI摻入和膜聯(lián)蛋白V染色的動力學20倍放大成像。比例尺：100 mm。 （C）從半纖維素裂解物（WCL）或從B6NT對照或B6cFLIP L -/-BMDMs的上清液中沉淀的所示半胱氨酸蛋白酶的全長和裂解產(chǎn)物。 （D）在LPS / 5z7刺激的B6巨噬細胞或LPS處理的cFLIP L -KD BMDM中用CASP3 / 7抑制劑抑制細胞死亡。 （E）用LPS或LPS / 5z7刺激的B6，Nlrp3-/-和Casp1-/-Casp11-/-巨噬細胞中的細胞死亡。 （F）B6，Rip3-/-Casp8-/-和Gsdmd-/-BMDM中的細胞死亡被擊倒并被刺激（如圖S3I所示的KD），刺激了cFLIPL。 （G）從B6NT控制器B6cFLIP L -KDBMDM刺激的全長和切割GSDMD所示。 在WT或YopJ缺陷型（DyopJ）Y。假性結(jié)核病刺激下的B6NT和B6cFLIP L -KD BMDM中，CASP8和GSDMD的細胞死亡和（I）裂解（圖S3L所示的KD的程度）。未感染，未感染。所有的免疫印跡和細胞死亡數(shù)據(jù)代表三個或更多獨立實驗。細胞死亡數(shù)據(jù)表示為一式三份孔的平均值±SD。
3.cFLIP L缺失促進LPS響應(yīng)
    cFLIP L不足足以驅(qū)動對LPS的復合物II的形成。 LPS / 5z7也推動了復合物II的形成，并且在早期時間點在復合物中檢測到了cFLIPL。 LFL誘導的cFLIP L -KD細胞中復合物II的形成依賴于TRIF和RIP1激酶活性。 在cFLIP L -KD細胞中，復雜II的形成和LPS誘導的細胞死亡都需要進行修飾。 因此，cFLIP L和RIP1的激酶活性調(diào)節(jié)TRIF信號下游的復合物II的形成，并決定細胞死亡的程度和方式。

                                         圖3. cFLIP L缺乏促進LPS響應(yīng)，在TRIF下游形成復合物II。
    （A）B6 BMDM中的cFLIP L蛋白水平被cFLIP L擊倒或用NT對照轉(zhuǎn)導。 （B）按指示刺激的B6 NT和B6 cFLIP L -KD BMDM中的FADD免疫沉淀（IP），并探測復合物II成分。（A）中顯示的敲低程度（C）B6和Trif-/-BMDM中的cFLIP L蛋白水平被cFLIP L擊倒或NT對照轉(zhuǎn)導。（D）B6和Trif-/-BMDM中的FADD IP被敲除cFLIP L，如所示被刺激，并探測復雜的II成分[（C）所示的敲低程度]。 （E）B6和RIP1Ki BMDM中的cFLIP L蛋白水平被cFLIP L擊倒或用NT對照轉(zhuǎn)導。 （F）B6和Trif-/-BMDM中的FADD IP擊倒cFLIP L，如所示進行刺激，并檢測復雜的II成分[（E）中所示的敲低程度]。 （G）B6 BMDM中的cFLIP L蛋白水平降低了cFLIP L或用NT控件進行轉(zhuǎn)導。 （H）如所示刺激2小時的B6 NT和B6 cFLIP L -KD中的FADD IP，并檢測復合物II成分[（G）中顯示的敲低程度）。 （I）B6 BMDM中的cFLIP L蛋白水平被cFLIP L擊倒或用NT對照轉(zhuǎn)導。 （J）LPS和LPS / 5z7刺激的cFLIP L沉默或NT對照B6和RIP1Ki BMDM中的總和pRIP1（S166）水平[（I）中顯示的敲低程度]。所有的免疫印跡代表三個或更多獨立實驗。
4.cFLIP L缺失，LPS激活的巨噬細胞迅速分泌IL-1b
    當cFLIP L水平低時，CASP8同型二聚體容易形成。完全活躍的CASP8裂解并激活遠處的靶標，LPS激活的巨噬細胞迅速經(jīng)歷熱解并分泌IL-1b。在不存在cFLIP L的情況下，CASP3，CASP7和CASP9對于CASP8驅(qū)動的細胞凋亡是必不可少的。相反，CASP8可能直接激活GSDMD來驅(qū)動細胞凋亡，而NLRP3炎癥小體來驅(qū)動IL-1b成熟和釋放。

                                       圖4. cFLIP L缺乏會驅(qū)動IL-1b成熟并響應(yīng)來自LPS的單個信號而釋放。
    （A到C）IL-1b從（A）B6 NT對照，B6 cFLIP L -/-和B6 cFLIP R -/-BMDM釋放; （B）為cFLIP L敲低的RIP1Ki和Trif-/-BMDM; （C）經(jīng)過指定治療6小時后，RIP3 / CASP8和GSDMD缺陷型BMDM敲低cFLIP L。（D）用LPS刺激4小時，或用LPS尼日利亞霉素刺激2小時的B6 NT對照和B6 cFLIP L-/- BMDM中的ASC斑點的代表性60X圖像（圖S4D中顯示的敲低程度）。比例尺：30毫米。在針對cFLIP L的B6，Rip3-/-Casp8-/-和Gsdmd-/-BMDM中ASC +細胞的百分比。 （F） IL-1b在b6，Nlrp3-/-和Casp1-/-Casp11-/-巨噬細胞中釋放，對于cFLIP L沉默并如所指示的被刺激。（G）B6 BMDM對cFLIP L沉默并用WT或缺乏YopJ的（DyopJ）假結(jié)核耶爾森氏菌6小時。 （H）由cFLIP L調(diào)節(jié)的LPS驅(qū)動的細胞凋亡和IL-1b產(chǎn)生的模型。 IL-1b釋放和ASC百分比數(shù)據(jù)表示為來自三個或更多獨立實驗的一式三份孔的平均值±SD。方差分析（ANOVA）用于比較各組。
結(jié) 論：
    長異構(gòu)體cFLIP L的缺乏會促進復合體II的形成，從而引起焦磷酸化，并且它們僅響應(yīng)LPS就能分泌IL-1b。