lncRNA調(diào)節(jié)自噬促進(jìn)缺血性心肌損傷

    長非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)在多種生物過程中都作為調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，但針對lncRNAs在急性心肌梗死(AMI)中的作用機制尚未明確闡明。文章“LncRNA 2810403D21Rik/Mirf promotes ischemic myocardial injury by regulating autophagy through targeting Mir26a”則填補了這一領(lǐng)域的空缺，闡述了lncRNA2810403D21Rik/AK007586/Mirf(心肌梗死調(diào)節(jié)因子)是如何通過調(diào)節(jié)Mir26a(MicroRNA 26a)抑制細(xì)胞大自噬/自噬。

摘 要：
    Mir26a被抑制在體外和體內(nèi)都會導(dǎo)致心臟損傷，而過度表達(dá)Mir26a通過靶向Usp15(泛素特異性肽酶15)激活自噬而減輕缺血應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。更重要的是，2810403D21Rik/Mirf作為Mir26a的競爭性內(nèi)源性RNA(Cerna)；2810403D21Rik/Mirf的強制表達(dá)下調(diào)Mir26a以抑制自噬。相反，2810403D21Rik/Mirf缺失導(dǎo)致Mir26a上調(diào)以促進(jìn)自噬并減輕心臟損傷，這反過來又改善了MI小鼠的心功能。這項研究鑒定了一個lncRNA 2810403D21Rik/Mirf，它通過對Mir26a的ceRNA活性起到抗自噬分子的作用。
技術(shù)路線：

一、 Mir26a在MI中的心臟保護(hù)作用：自噬作用
    Mir26a在MI小鼠（圖一A）和 H2O2處理的新生小鼠心肌細(xì)胞（NMCMs）（圖一B）中減少。AMO-26a是Mir26a抑制劑，用AMO-26a轉(zhuǎn)染NMCMs 24 h，然后再轉(zhuǎn)染tandem-LC3構(gòu)建體(GFP-MRFP-LC3)24 h，可觀察到NMCM中自噬體(黃斑點)和自噬溶酶體 (紅斑點)的數(shù)量減少（圖一C）。Mir26a的敲低使SQSTM1/p62蛋白水平升高，LC3-II表達(dá)降低（圖一D）。Mir26a海綿轉(zhuǎn)基因小鼠（Mir26a KD）小鼠中Mir26a表達(dá)下調(diào)（圖一E）。內(nèi)源性Mir26a的沉默降低了左心室射血分?jǐn)?shù)和左心室短軸縮短率（分別為EF和FS；圖1F），左心室功能受損。抑制Mir26a阻礙自噬小體的形成，導(dǎo)致Mir26a KD小鼠心臟自噬的下調(diào)(圖1G)。

    將Mir26a 模擬物轉(zhuǎn)染到NMCMs中，Mir26a過表達(dá)可減輕H2O2對NMCM細(xì)胞活力的抑制作用（圖二A），同時可以增強促進(jìn)了自噬體的形成和自噬體-溶酶體的融合（圖二B），而自噬拮抗劑3-甲基腺嘌呤3-MA可以抑制這兩種效應(yīng)。
    尾靜脈注射膽固醇偶聯(lián)Mir26a模擬物（AgoMir26a）到小鼠體內(nèi)進(jìn)行過表達(dá)，然后建立MI小鼠模型。Mir26a過表達(dá)改善了MI模型小鼠的心臟功能并縮小了梗死面積（圖二C & D），增強MI小鼠的自噬活性（圖二E），使MI小鼠自噬相關(guān)蛋白的異常表達(dá)正?；▓D二F）。

二、心肌保護(hù)作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制Mir26a：Usp15的抑制
    利用TargetScan miRNA數(shù)據(jù)庫計算分析發(fā)現(xiàn)，編碼Usp15的基因包含了Mir26a的種子序列，序列比對顯示小鼠，大鼠和人Mir26a和Usp15基因之間的互補性，種子區(qū)中匹配的堿基對用紅色和綠色標(biāo)出（圖三A）。
    MI小鼠心臟梗死邊緣區(qū)和暴露于H2O2的心肌細(xì)胞中Usp15表達(dá)呈上調(diào)（圖三B，C）。構(gòu)建攜帶野生型（WT）Mir26a結(jié)合位點或Mir26a結(jié)合位點突變版本的熒光素酶表達(dá)載體。共轉(zhuǎn)染過表達(dá)Mir26a可抑制攜帶WT Usp15結(jié)合位點的熒光素酶載體或結(jié)合位點1突變（mut-1）的熒光素酶活性，但不抑制攜帶位點2突變（mut-2）或同時攜帶位點1和2（mut-3）的熒光素酶活性（圖三D）。Mir26a降低USP15蛋白水平，AMO-26a增加USP15蛋白水平，但兩者都不影響Usp15的轉(zhuǎn)錄（圖三E & F）。Mir26aKD小鼠中USP15表達(dá)上調(diào)（圖三G）。NMCMs中Mir26a的強制表達(dá)抑制了SQSTM1的表達(dá)，并促進(jìn)LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化（圖三H）。

三、LncRNA2810403D21Rik/Mirf能夠與Mir26a結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性
    使用Miranda數(shù)據(jù)庫在具有Mir26a結(jié)合位點的小鼠中鑒定lncRNA，根據(jù)它們在MI小鼠中的表達(dá)譜過濾候選lncRNA，選擇在MI小鼠中顯著上調(diào)的lncRNA AK007586進(jìn)行進(jìn)一步分析，并命名為2810403D21Rik/Mirf（圖四A）。
    經(jīng)H2O2處理后，NMCM中2810403D21Rik/Mirf的表達(dá)顯著增加（圖四B）。原位雜交顯示2810403D21Rik/Mirf主要位于NMCM的細(xì)胞質(zhì)中（圖四C）。2810403D21Rik/Mirf過表達(dá)會抑制NMCM中Mir26a的表達(dá)（圖四D），而ShRNA沉默2810403D21Rik/Mirf則導(dǎo)致Mir26a上調(diào)（圖四E）。
    構(gòu)建包含2810403D21Rik/Mirf序列片段的Mir26a傳感器熒光素酶載體，此序列包括并入熒光素酶基因的3‘-UTR中的Mir26a結(jié)合位點（圖四F）。2810403D21Rik/Mirf的過表達(dá)增加了熒光素酶的活性，使其沉默則具有相反的效果（圖四G）。Mir26a顯著抑制傳感器載體的熒光素酶活性，這種抑制可被WT 2810403D21Rik/Mirf的共表達(dá)緩解，而mut-2810403D21Rik/Mirf不能（圖四H）。過表達(dá)Mir26a抑制WT 2810403D21Rik/Mirf熒光素酶載體的熒光素酶活性，但不抑制mut-2810403D21Rik/Mirf熒光素酶載體的熒光素酶活性（圖四I）。
    構(gòu)建生物素標(biāo)記的2810403D21Rik/Mirf特異性探針，并進(jìn)行RNA親和分離實驗，miRNA、miRNA靶RNA和AGO2形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)介導(dǎo)miRNA誘導(dǎo)的基因沉默。RNA親和分離實驗顯示2810403D21Rik/Mirf與AGO2相互作用（圖四J），qRT-PCR顯示2810403D21Rik/Mirf與Mir26a結(jié)合（圖四K）。將生物素化的Mir26a轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞用于基于生物素的親和分離實驗，發(fā)現(xiàn)2810403D21Rik/Mirf被Mir26a拉下（圖四L & M）。綜上所述，這些結(jié)果表明2810403D21Rik/Mirf直接與Mir26a和AGO2相互作用形成RISC，并調(diào)節(jié)Mir26a的表達(dá)和活性。

四、lncRNA2810403D21Rik/Mirf作為經(jīng)由Mir26a-Usp15軸的自噬調(diào)節(jié)因子
    用2810403D21Rik/Mirf轉(zhuǎn)染NMCMs。2810403D21Rik/Mirf過表達(dá)降低NMCMs的活性，加重H2O2誘導(dǎo)的NMCMs心肌損傷，而Mir26a可部分緩解這種影響（圖5A，B）。2810403D21Rik/Mirf的強制表達(dá)減少了NMCM中自噬小體和自溶酶體的數(shù)量（圖5C）。2810403D21Rik/Mirf過表達(dá)增加了SQSTM1的表達(dá)，并抑制了LC3-II，ATG7，BECN1和ATG5的表達(dá)（圖5D）。強制表達(dá)Mir26a減輕2810403D21Rik/Mirf對自噬的抑制（圖5C，D）。這些結(jié)果表明，2810403D21Rik/Mirf限制了Mir26a/Usp15軸的功能，從而抑制自噬并通過減輕固有的心臟保護(hù)活動引起心肌損傷。

    沉默2810403D21Rik/Mirf可減輕H2O2誘導(dǎo)的心肌損傷，這一作用可被AMO-26a敲除Mir26a或3-MA抑制NMCM中的自噬而逆轉(zhuǎn)（圖六A）。使用si-ATG5、氯喹或Pepstatin A/E64d阻斷自噬可恢復(fù)2810403D21Rik/Mirf沉默在H2O2處理的NMCM中的促存活效應(yīng)（圖六B）。western blot顯示可恢復(fù)H2O2誘導(dǎo)的自噬相關(guān)蛋白的異常表達(dá)，這些調(diào)節(jié)變化通過添加AMO-26a或3-MA而減弱（圖六C）。2810403D21Rik/Mirf沉默減輕了H2O2誘導(dǎo)的NMCM中自噬的抑制，通過添加Mir26a抑制劑或3-MA有效地恢復(fù)了抑制(圖6D)。這些數(shù)據(jù)表明2810403D21Rik/Mirf沉默通過激活Mir26a和自噬保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

    f-2810403D21Rik/Mirf（含有Mir26a結(jié)合位點的2810403D21Rik/Mirf序列的25nt片段）的引入可抑制NMCM的活力，這種作用被Mir26a消除（圖七A）。f-2810403D21Rik/Mirf在NMCM中具有抗自噬作用，可以通過引入Mir26a來消除（圖七B）。f-2810403D21Rik/Mirf的強制表達(dá)通過調(diào)節(jié)Mir26a干擾自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，這些效應(yīng)幾乎被Mir26a完全逆轉(zhuǎn)（圖七C）。這些結(jié)果表明f-2810403D21Rik/Mirf可以模擬2810403D21Rik/Mirf對自噬和細(xì)胞損傷的作用，表明Mir26a結(jié)合位點是2810403D21Rik/Mirf的功能域。

五、沉默2810403D21Rik/Mirf減輕心肌損傷并保護(hù)心肌梗死小鼠的心功能
    將攜帶2810403D21Rik/Mirf特異性shRNA的腺病毒相關(guān)病毒(AAV)-9注射到小鼠體內(nèi)，以評估2810403D21Rik/Mirf抑制對心臟損害的影響。抑制2810403D21Rik/Mirf后WT小鼠心臟中Mir26a的表達(dá)上調(diào)（圖八A）。
    敲除2810403D21Rik/Mirf在WT小鼠中誘導(dǎo)Mir26a上調(diào)（圖8A）。2810403D21Rik/Mirf缺失改善了MI后小鼠的心臟功能并縮小了梗死范圍（圖8B，C）。2810403D21Rik/Mirf的敲除增加了自噬小泡(箭頭)的數(shù)量，并促進(jìn)了MI心臟的自噬（圖8D）。western blot顯示2810403D21Rik/Mirf在MI小鼠中的抑制恢復(fù)了SQSTM1和USP15的上調(diào)，挽救了ATG7，BECN1和ATG5的下調(diào)，并促進(jìn)了LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)變（圖8E）。這些結(jié)果表明，沉默2810403D21Rik/Mirf可能調(diào)節(jié)自噬，并對缺血性損傷提供保護(hù)作用。