自噬相關(guān)蛋白PIK3C3/VPS34控制T細(xì)胞代謝和功能

    Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3K）復(fù)合物的PIK3C3/VPS34亞基是大自噬/自噬的早期關(guān)鍵因子。在這項(xiàng)研究中，我們評(píng)估了PIK3C3對(duì)T細(xì)胞代謝和功能的貢獻(xiàn)。這篇文章發(fā)表于“Autophagy”，題目為“Autophagy-related protein PIK3C3/VPS34 controls T cell metabolism and function”。

    在這篇研究中，我們發(fā)現(xiàn)Pik3c3-31缺陷型T細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞代謝受損，Pik3c3缺陷型CD4+T 細(xì)胞未能分化為T輔助細(xì)胞。這些改變與T細(xì)胞活化時(shí)活性線粒體減少水平有關(guān)。此外，有條件的Pik3c3缺陷動(dòng)物未能產(chǎn)生自身反應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）有抵抗力。有趣的是，Pik3c3的缺失對(duì)動(dòng)物清除腫瘤轉(zhuǎn)移的能力幾乎沒有影響。
結(jié) 果：
1.Pik3c3基因在T細(xì)胞中的缺失重組基因表達(dá)
    為了更好地了解Pik3c3缺失對(duì)T細(xì)胞功能的潛在影響，我們產(chǎn)生了Pik3c3f/f，Cd4-Cre小鼠，其在T細(xì)胞中表現(xiàn)出選擇性的Pik3c3消融。我們研究了來自Pik3c3f/f 和pik3c3f/f，Cd4-Cre小鼠的富含F(xiàn)ACS的CD4+和CD8A+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。RNA測序分析顯示，轉(zhuǎn)錄水平在全基因組范圍內(nèi)發(fā)生了顯著變化。CD4+T細(xì)胞中Pik3c3缺乏顯著誘導(dǎo)或降低基因表達(dá)，包括Pik3c3（圖1A）。隨后的途徑富集分析確定了Pik3c3缺陷CD4+T細(xì)胞中受影響有糖酵解/糖異生、氨基酸生物合成、N-聚糖生物合成和cAMP信號(hào)途徑（圖1B）。CD8A+T細(xì)胞中Pik3c3缺陷也誘導(dǎo)或減少基因表達(dá)，包括Pik3c3（圖1C）。然而，富集分析沒有顯示任何細(xì)胞代謝改變的證據(jù)（圖1D）。相反，受影響最顯著的途徑與唾液分泌、MAPK 信號(hào)途徑和麻疹相關(guān)（圖1D）。許多細(xì)胞代謝相關(guān)基因在CD4+T中被調(diào)控超過10倍（圖1E）。我們還觀察到Pik3c3缺陷性CD4+T細(xì)胞中Th1細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Tbx21的表達(dá)降低（圖1E）。相比之下，其他Th細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子如Gata3、Rorc和Foxp3的表達(dá)沒有顯著差異（圖1E）。

2.Pik3c3缺失引起活化T細(xì)胞線粒體功能和代謝的改變
    我們之前已經(jīng)證明pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠的外周T細(xì)胞丟失是由于細(xì)胞器的積累和穩(wěn)態(tài)時(shí)細(xì)胞凋亡的增加。因此，我們進(jìn)一步研究了PIK3C3在T細(xì)胞克隆擴(kuò)增過程中對(duì)T細(xì)胞存活的作用。我們用抗CD3E和抗CD28抗體對(duì)Pik3c3f/f和pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行了刺激，并用流式細(xì)胞儀測定了刺激后活細(xì)胞的百分比。Pik3c3缺失T細(xì)胞的百分比明顯低于富含Pik3c3 的T細(xì)胞，后者增殖緩慢（圖2A和2B）。由于自噬是維持激活后ATP產(chǎn)生的必要條件，我們接下來評(píng)估了自噬失敗對(duì)T細(xì)胞代謝的影響。我們用細(xì)胞外流量分析儀測量了活化T細(xì)胞的耗氧率（OCR）和細(xì)胞外酸化率（ECAR）的變化，分析了活化T細(xì)胞的線粒體呼吸和有氧糖酵解。Pik3c3缺乏顯著降低活化的CD4+和CD8A+T 細(xì)胞的OCR和ECAR（圖2C、2D）。這一結(jié)果證實(shí)了RNA序列數(shù)據(jù)，即與糖酵解和氧化磷酸化相關(guān)的基因被下調(diào)（圖1E）。有趣的是，與CD8A+T細(xì)胞相比，CD4+T細(xì)胞OCR和ECAR的降低更為顯著。
    為探討Pik3c3f/f和 pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠T細(xì)胞代謝的不同機(jī)制，我們評(píng)估了T細(xì)胞系的線粒體質(zhì)量和功能。與對(duì)照T細(xì)胞相比，缺乏Pik3c3的CD4+和CD8A+T細(xì)胞的基礎(chǔ)Mitoview（線粒體膜染色）染色增強(qiáng)，表明缺乏Pik3c3時(shí)線粒體有積累（圖2E和2F）。在Pik3c3f/f和pik3c3f/f；CD4-Cre小鼠中，CD4+或CD8A+T細(xì)胞的激活導(dǎo)致了有絲分裂染色的顯著增加（圖2E和2F）。然而，與Pik3c3缺陷的CD4+T細(xì)胞相比，Mitoview染色在Pik3c3足夠的CD4+T細(xì)胞中的增加更為顯著。我們假設(shè)，Pik3c3缺陷T細(xì)胞代謝減少可能是由于線粒體狀態(tài)的改變和線粒體負(fù)荷。為了測試這一點(diǎn)，我們用四甲基羅丹明乙酯高氯酸鹽（TMRE）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)與Pik3c3f/f；Cd4 Cre小鼠相比，刺激導(dǎo)致Pik3c3f/f小鼠的CD4+和CD8A+T細(xì)胞線粒體膜電位升高（圖2E和2F）。CD4+T細(xì)胞活化誘導(dǎo)TMRE的增加比CD8A+T細(xì)胞的高?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明PIK3C3在T細(xì)胞活化過程中維持健康的線粒體負(fù)荷增加需要，特別是在CD4+T細(xì)胞中。

3.T細(xì)胞Pik3c3缺失抑制Th1細(xì)胞分化
    先前的研究表明，自噬在不同的T輔助亞群中受到不同的調(diào)節(jié)。因此，我們接下來評(píng)估Pik3c3缺乏是否調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞分化。我們在Th1、Th2、Th17和Treg偏斜條件下培養(yǎng)MACS分選的Pik3c3足夠和缺失的CD4+SELL/CD62L+T細(xì)胞，然后用抗CD3E抗體重新激活細(xì)胞，以評(píng)估每個(gè)亞群的標(biāo)志性細(xì)胞因子或轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)在這些不同極化條件下培養(yǎng)的原始CD4+T細(xì)胞在Pik3c3缺失時(shí)對(duì)細(xì)胞死亡有不同的敏感性。Pik3c3缺乏的T細(xì)胞在Th1下，Th2和Treg條件下培養(yǎng)更加敏感，而在Th17細(xì)胞培養(yǎng)條件下對(duì)細(xì)胞死亡敏感性相對(duì)較低（圖3 A和B）。在Th1細(xì)胞條件下，在缺乏Pik3c3的情況下，產(chǎn)生IFNG細(xì)胞的比例顯著降低（圖3C和3D）。然而，在Th2條件下培養(yǎng)的細(xì)胞中， IL4的表達(dá)沒有差異，IL17A在Th17條件下培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)沒有差異，F(xiàn)OXP3在Treg條件下培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)沒有差異，（圖3C和3D）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了我們的RNA序列研究中轉(zhuǎn)錄變化的無偏測量，表明減少了Tbx21的表達(dá)，但在缺乏CD4+T細(xì)胞中Gata3、Rorc和Foxp3的表達(dá)沒有差異（圖1E）。

4.T細(xì)胞Pik3c3缺乏導(dǎo)致對(duì)EAE誘導(dǎo)的抵抗
    我們推測Pik3c3缺失抑制自身免疫反應(yīng)的發(fā)展。我們使用多發(fā)性硬化的EAE模型來測試T細(xì)胞中Pik3c3缺失是否導(dǎo)致EAE誘導(dǎo)的抵抗。結(jié)果表明，pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠對(duì)EAE完全耐藥，而在同一實(shí)驗(yàn)中，所有pik3c3f/f小鼠均出現(xiàn)EAE征象（圖4A）。我們認(rèn)為pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠對(duì)EAE誘導(dǎo)的抗性增加可能與T細(xì)胞啟動(dòng)減少有關(guān)。因此，我們評(píng)估了抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠中，MOG 211（髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白）特異性IFNG+CD4+T細(xì)胞顯著減少（圖4B）。IL17+CD4+T細(xì)胞也適度減少，盡管沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4B）。另外，我們發(fā)現(xiàn)所有的rubcn-/-小鼠都出現(xiàn)了EAE癥狀，與WT對(duì)照小鼠相似（圖4C）。這些結(jié)果表明pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠對(duì)EAE誘導(dǎo)的保護(hù)作用最有可能不是由有缺陷的非規(guī)范自噬引起的。
    為了更好地確定EAE對(duì)T細(xì)胞Pik3c3缺乏的抗性，我們用Rosa26-CreERT2小鼠培育Pik3c3f/f小鼠，產(chǎn)生Pik3c3f/f；Rosa26-CreERT2小鼠。從MOG35-55免疫動(dòng)物獲得的4-OH三苯氧胺處理的ER-Cre+細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到同源WT（PTPRCa/CD45.1）動(dòng)物，導(dǎo)致對(duì)EAE發(fā)育的保護(hù)，而在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，接受載體處理的ER-Cre+細(xì)胞的動(dòng)物出現(xiàn)EAE跡象（圖4D）。我們隨后測定了小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤白細(xì)胞的頻率。接受4-OH三苯氧胺處理的ER-Cre+細(xì)胞的小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤PTPRCb/CD45.2+細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的比例明顯低于接受載體處理的ER-Cre+細(xì)胞的小鼠（圖4E和4F）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，PIK3C3在自身免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)和效應(yīng)階段都具有關(guān)鍵作用。

5.未改變的腫瘤轉(zhuǎn)移易感性
    為了確定Pik3c3在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要性，我們用靜脈注射Lewis肺癌（LLC）細(xì)胞或B16黑色素瘤細(xì)胞對(duì)Pik3c3f/f和pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠進(jìn)行了檢測，并監(jiān)測了肺腫瘤的定植情況。有趣的是，與Pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠相比，Pik3c3f/f小鼠具有相似的LLC和B16黑色素瘤腫瘤負(fù)荷（圖5A-C）。為了更好地理解潛在的機(jī)制，我們分析了腫瘤定植肺中的免疫細(xì)胞群。我們在Pik3c3f/f和Pik3c3f/f；Cd4-Cre小鼠的肺中發(fā)現(xiàn)了相似的細(xì)胞總數(shù)。腫瘤的免疫組織學(xué)分析證實(shí)pik3c3f/f；CD4-Cre小鼠CD4+T細(xì)胞和CD8A+T細(xì)胞的頻率降低（圖5D）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示， pik3c3f/f；CD4-Cre小鼠CD4+T細(xì)胞、CD8A+T細(xì)胞和Tregs、未改變的B細(xì)胞和MDSCs的頻率顯著降低，而KLRB1C/NK1.1+細(xì)胞增加（圖5E和5F）。CD8A+T細(xì)胞表型分析顯示pik3c3f/f；Cd4-Cre 255小鼠的效應(yīng)細(xì)胞CD44+SELL-T細(xì)胞頻率增加（圖5G）。然而，Pik3c3缺乏并沒有改變PTPRC/CD45+257細(xì)胞對(duì)LLC腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞溶解功能（圖5H和5I）?？偟膩碚f，結(jié)果表明，T細(xì)胞中Pik3c3的缺失對(duì)效應(yīng)細(xì)胞清除腫瘤轉(zhuǎn)移的功能影響有限。

結(jié) 論：
    總之，我們的數(shù)據(jù)揭示了PIK3C3在T細(xì)胞代謝和功能中的關(guān)鍵作用。T細(xì)胞中的PIK3C3在EAE過程中也可能通過典型的自噬依賴途徑參與這些細(xì)胞的致病性。因此，我們的研究對(duì)通過靶向PIK3C3治療多發(fā)性硬化和其他自身免疫性疾病的有效免疫療法的發(fā)展具有意義。