m6A甲基化通過(guò)FOXO3介導(dǎo)的自噬調(diào)節(jié)肝癌索拉非尼耐藥

    m6A是mRNA中一種豐富的核苷酸修飾物，它可以調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性、剪接和翻譯，但它是否在腫瘤內(nèi)微環(huán)境和腫瘤耐藥中也有生理作用尚不清楚。因此小編為大家?guī)?lái)發(fā)表于“The EMBO Journal”的文章“RNA m6A methylation regulates sorafenib resistance in liver cancer through FOXO3-mediated autophagy”，讓大家了解m6A甲基化調(diào)節(jié)肝癌索拉非尼耐藥的機(jī)制。

結(jié) 果：
1.在索拉非尼耐藥的肝細(xì)胞癌中METTL3下調(diào)
    為了探討索拉非尼耐藥在肝癌中的分子機(jī)制，我們從長(zhǎng)期接受索拉非尼治療的患者中獲得了索拉非尼耐藥的肝腫瘤，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。我們發(fā)現(xiàn)索拉非尼耐藥肝腫瘤中819個(gè)基因顯著上調(diào)，775個(gè)基因顯著下調(diào)。利用KOBAS進(jìn)行的基因富集分析發(fā)現(xiàn)了與耐藥性有關(guān)的幾種信號(hào)通路的失調(diào)，包括細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)、對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)和對(duì)氮化合物的反應(yīng)（圖1A）。在這四條信號(hào)通路中有13個(gè)基因重疊（圖1B）。我們發(fā)現(xiàn)METTL3在索拉非尼耐藥肝癌中顯著下調(diào)（圖1C）。通過(guò)RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了METTL3在索拉非尼耐藥的肝腫瘤中的下調(diào)作用（圖1D）。通過(guò)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌的病理分期圖，我們發(fā)現(xiàn)METTL3的表達(dá)水平在肝癌的晚期顯著下調(diào)（圖1E）。這些結(jié)果表明METTL3的下調(diào)可能與HCC中的索拉非尼耐藥有關(guān)。
    為了證實(shí)METTL3在索拉非尼耐藥中的作用，我們系統(tǒng)地分析了GSE62813數(shù)據(jù)庫(kù)中METTL3在HepG-2細(xì)胞和索拉非尼耐藥的HepG-2細(xì)胞中表達(dá)的變化。我們發(fā)現(xiàn)METTL3在索拉非尼耐藥肝癌細(xì)胞中顯著下調(diào)（圖1F）。通過(guò)與原始 HepG-2細(xì)胞的比較，我們證實(shí)了這些HepG2細(xì)胞對(duì)索拉非尼的獲得性耐藥（圖1G）。另外，我們發(fā)現(xiàn)METTL3在抗索拉非尼的 HepG-2細(xì)胞中顯著降低，總RNA m6A水平持續(xù)下降（圖1H和I），表明METTL3在肝癌細(xì)胞中介導(dǎo)抗索拉非尼的潛在作用。

2.METTL3基因敲除增強(qiáng)肝癌中索拉非尼耐藥
    為了評(píng)估整體m6A水平是否與肝癌的發(fā)生有關(guān)，我們?cè)谡８渭?xì)胞系WRL68中產(chǎn)生了一系列不同表達(dá)水平的METTL3。正常肝細(xì)胞在METTL3沉默后形成一個(gè)擴(kuò)大的集落，但在METTL3過(guò)表達(dá)后沒(méi)有明顯變化（圖2A和B）。METTL3敲除后SMMC-7721、Bel-7402和HepG-2細(xì)胞對(duì)索拉非尼治療的敏感性的增加（圖2C和D）。此外，為了確定m6A在肝癌索拉非尼耐藥中的作用，我們進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)（圖2E和F）。我們的結(jié)果表明，挽救抗shRNA野生型METTL3會(huì)使METTL3敲除肝癌細(xì)胞和抗索拉非尼HepG-2細(xì)胞對(duì)索拉非尼治療敏感（圖2G-J），提示METTL3介導(dǎo)的m6A修飾在肝癌索拉非尼耐藥中的重要作用。
    為了進(jìn)一步確定METTL3是如何控制肝癌中索拉非尼耐藥的，我們測(cè)定了METTL3對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成管能力的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，METTL3基因敲除組的肝癌細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤條件培養(yǎng)基顯示出更強(qiáng)的HUVEC管形成的能力(圖2K和K-1)。此外，METTL3基因敲除可上調(diào)缺氧條件下肝癌細(xì)胞中FGF、PDGF-B、STAT3和VEGF-A等血管生成標(biāo)志物的RNA表達(dá)（圖2L和M）。Western blot進(jìn)一步證實(shí)了VEGF-A和PDGF-B的誘導(dǎo)蛋白水平（圖2N和O）。綜上所述，我們的結(jié)果表明METTL3缺失增強(qiáng)了肝癌中的索拉非尼耐藥性。

3.METTL3依賴的索拉非尼在肝癌中的耐藥是通過(guò)促進(jìn)肝癌的自噬介導(dǎo)的
    先前的報(bào)告顯示，自噬與人類癌癥的化療抵抗有關(guān)。為探討m6A調(diào)節(jié)是否參與自噬介導(dǎo)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼耐藥，采用透射電鏡觀察了缺氧條件下含或不含METTL3耗竭的SMMC-7721細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。我們的結(jié)果表明，METTL3基因敲除增加了自噬體的數(shù)量（圖3A）。為了進(jìn)一步證實(shí)這一現(xiàn)象，我們測(cè)量了自噬中的生物標(biāo)志物L(fēng)C3的脂質(zhì)水平。結(jié)果表明，METTL3基因敲除顯著增加了肝癌細(xì)胞系中LC3-II的積累（圖3B-D）。抗索拉非尼的HepG-2細(xì)胞中LC3-II的積累也增強(qiáng)，與親本細(xì)胞相比，其METTL3的表達(dá)相對(duì)較低（圖3E）。值得注意的是，我們通過(guò)熒光免疫染色檢測(cè)到GFP-LC3在METTL3基因敲除的肝癌細(xì)胞和索拉非尼耐藥的HepG-2細(xì)胞中的亞細(xì)胞重新分布增加。挽救野生型METTL3減少了GFP-LC3在這些細(xì)胞中的積累（圖3F-H）。為了探討自噬在METTL3缺失引起的索拉非尼耐藥中的作用，我們測(cè)定了IC50。3-MA治療降低了METTL3基因敲除介導(dǎo)的LC3-II積累（圖3I-K），并使3-MA治療組索拉非尼的IC50顯著降低（圖3L-N）。這些結(jié)果表明METTL3的缺失增加了索拉非尼的自噬通量。

4.METTL3通過(guò)介導(dǎo)FOXO3信號(hào)調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞自噬
    我們探討了METTL3缺失激活肝癌自噬的機(jī)制。基因集富集分析揭示了細(xì)胞對(duì)逆境基因反應(yīng)途徑的富集。GSEA中富集了23個(gè)有顯著變化的基因（圖4A）。KEGG分析表明，F(xiàn)OXO3是一種普遍的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)METTL3敲低時(shí)，其自噬信號(hào)途徑發(fā)生了顯著變化（圖4B）。為了確定METTL3如何調(diào)控肝癌中的FOXO3，我們首先檢測(cè)了METTL3基因敲除后FOXO3的表達(dá)水平。我們證實(shí)在穩(wěn)定的METTL3敲除細(xì)胞中，F(xiàn)OXO3在蛋白質(zhì)和RNA水平上顯著下調(diào)（圖4C）。此外，經(jīng)ActinomycinD和Cycloheximide處理后，METTL3基因敲除細(xì)胞中FOXO3 mRNA的半衰期和蛋白水平較對(duì)照細(xì)胞顯著降低（圖4D和E）。通過(guò)RNA組分離，我們發(fā)現(xiàn)METTL3敲除顯著降低了FOXO3在40S組分下的翻譯效率（圖4F）。接下來(lái)，為了確定調(diào)節(jié)FOXO3表達(dá)水平的潛在m6A讀取器，我們?cè)贐el-7402細(xì)胞中敲除了YTHDF1和YTHDF2（圖4G）。敲除YTHDF1消除了METTL3過(guò)表達(dá)Bel-7402細(xì)胞中FOXO3蛋白水平的升高（圖4H）。反過(guò)來(lái)，YTHDF1的缺失顯著降低了FOXO3的RNA表達(dá)水平（圖4I），表明YTHDF1可能通過(guò)m6A修飾參與了FOXO3表達(dá)的調(diào)控。
    為了證明m6A調(diào)控對(duì)YTHDF1介導(dǎo)的FOXO3表達(dá)的影響，我們將FOXO3 3’UTR克隆到一個(gè)雙熒光素酶報(bào)告子結(jié)構(gòu)中，產(chǎn)生FOXO3 3’UTR的突變形式（圖4K）。在不同濃度METTL3的Bel-7402細(xì)胞中測(cè)定了野生型和突變型FOXO3 3’UTR的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性。在METTL3敲除和YTHDF1敲除細(xì)胞中檢測(cè)到野生型FOXO3的熒光素酶活性降低。相反，對(duì)于FOXO3的3’UTR突變形式，METTL3或YTHDF1的缺失沒(méi)有任何影響（圖4L）。在METTL3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，YTHDF1的缺失消除了野生型FOXO3對(duì)熒光素酶活性的誘導(dǎo)（圖4L）。此外，為了驗(yàn)證FOXO3作為缺氧條件下METTL3介導(dǎo)的m6A修飾的真實(shí)靶點(diǎn)，我們進(jìn)行了m6A RNA免疫沉淀分析（MeRIP）和YTHDF1-RIP分析，并通過(guò)RT-PCR進(jìn)行了分析。METTL3的敲除顯著降低了FOXO3 mRNA的m6A水平（圖4M），并降低了YTHDF1與FOXO3 mRNA的結(jié)合（圖4N）。此外，通過(guò)對(duì)肝腫瘤數(shù)據(jù)集的分析，我們發(fā)現(xiàn)在mRNA水平上，YTHDF1與FOXO3（圖4O）和METTL3與FOXO3（圖4P）呈顯著正相關(guān)。總之，我們證實(shí)FOXO3是METTL3介導(dǎo)的肝癌m6A修飾的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

5.過(guò)表達(dá)FOXO3通過(guò)抑制自噬挽救肝癌m6A依賴性索拉非尼敏感性
    為了研究FOXO3在自噬信號(hào)途徑中直接靶點(diǎn)之間的連接性，我們分析了兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，其中FOXO3由強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)。FOXO3在自噬中的過(guò)表達(dá)下調(diào)了基因表達(dá)譜，而在SMMC-7721細(xì)胞中，F(xiàn)OXO3的敲除誘導(dǎo)了自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄（圖5A）。與METTL3的下調(diào)一致，F(xiàn)OXO3在索拉非尼耐藥的HepG-2細(xì)胞中顯著下調(diào)（圖5B）。敲除FOXO3可提高肝癌細(xì)胞系的自噬活性（圖5C）。為了確定FOXO3是否在METTL3依賴性自噬中起關(guān)鍵作用，我們過(guò)表達(dá)FOXO3。結(jié)果表明，F(xiàn)OXO3在METTL3基因敲除細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)降低了自噬活性（圖5E），減少了自噬體的數(shù)量（圖5F），并延緩了GFP-LC3的亞細(xì)胞再分布（圖5G）。同樣，在索拉非尼耐藥的HepG-2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FOXO3的熒光免疫染色顯示相同結(jié)果（圖5H）。我們還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3的過(guò)表達(dá)顯著影響了m6A介導(dǎo)的耐藥肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的治療（圖5I-L）。綜上所述，這些結(jié)果表明FOXO3在肝癌中METTL3耗竭介導(dǎo)的索拉非尼耐藥中起著關(guān)鍵作用。

6.體內(nèi)METTL3缺失通過(guò)METTL3/FOXO3軸顯著增強(qiáng)索拉非尼抗性
    為了驗(yàn)證METTL3在肝癌進(jìn)展中介導(dǎo)索拉非尼耐藥中的作用，我們建立了同種異體移植小鼠模型，并給藥：DMSO和索拉非尼（50 mg/kg/2天，腹腔注射）。與我們之前的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，隨著腫瘤大小和腫瘤重量的增加，METTL3基因敲除顯著地消除了索拉非尼體內(nèi)治療的抑制作用（圖6A-C）。此外，我們將Bel-7402細(xì)胞直接注射到NOD-SCID小鼠的肝實(shí)質(zhì)中，建立了原位移植性肝癌模型。與對(duì)照組相比，METTL3基因敲除消除了索拉非尼對(duì)肝腫瘤微環(huán)境的抑瘤作用（圖6D和E）。為了進(jìn)一步證實(shí)METTL3/FOXO3軸在體內(nèi)肝癌中的作用，我們構(gòu)建了同種異體移植小鼠模型，并像以前一樣開(kāi)始給藥。一致地，METTL3的敲除顯著地消除了索拉非尼在體內(nèi)的抑制作用。值得注意的是，在METTL3敲除的Hepa1-6細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FOXO3挽救了索拉非尼敏感性效應(yīng)，這反映在與溶劑治療組相比，腫瘤大小和腫瘤重量顯著減少（圖6F-H）。與單獨(dú)使用METTL3相比，在索拉非尼治療的METTL3敲除的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FOXO3顯示出增殖、自噬和血管生成減少（圖6I-L）。
    此外，我們?cè)贐ALB/C裸鼠中建立了兩個(gè)肝癌患者來(lái)源的異種移植（PDX）模型，并用四種方案給藥（圖7A）。與索拉非尼治療對(duì)照組（圖7B-D和I）相比，METTL3損耗顯著地挽救了異種移植瘤的生長(zhǎng)，后者分別表現(xiàn)為Ki67（圖7F）、LC3-B（圖7G）和VEGF-A（圖7H）所示的增殖、自噬和血管生成增加（圖7E）。綜上所述，我們得出結(jié)論：體內(nèi)METTL3缺失主要通過(guò)METTL3/FOXO3軸顯著增強(qiáng)索拉非尼抗性。

結(jié) 論：
    我們的工作揭示了METTL3介導(dǎo)的m6A修飾在缺氧腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵作用，并確定FOXO3是m6A修飾在肝癌抗索拉非尼治療中的重要靶點(diǎn)。