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研究背景:
1. LncRNA參與了各種生理和病理過程，在也腫瘤進展中起關(guān)鍵作用，并在各種癌癥中異常表達。
2. LncRNA可能起競爭內(nèi)源性RNA(ceRNA)的作用，從而調(diào)節(jié)miRNA的生物學(xué)功能或表達。
3. 具有M2表型的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)是腫瘤微環(huán)境中最豐富的免疫相關(guān)細(xì)胞，并通過介導(dǎo)血管生成、轉(zhuǎn)移和免疫參與腫瘤發(fā)展。
4. 缺氧是腫瘤微環(huán)境(TME)的主要特征，它與許多實體瘤的進展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。
5. HIF-1α是一個廣泛研究的缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)，它通過下游靶基因的反式激活介導(dǎo)細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)。 在常氧條件下，HIF-1α受到蛋白酶體降解，而低氧條件則保護HIF-1α不被降解，從而使HIF-1α易位到細(xì)胞核中以啟動基因表達。
該研究基于公共數(shù)據(jù)庫并結(jié)合生物信息學(xué)分析，檢測了lncRNA BCRT1在乳腺癌組織中的過表達，并在一組乳腺癌組織中進行了進一步的驗證。通過體外和體內(nèi)實驗確定了lncRNA BCRT1對增殖，遷移，侵襲和巨噬細(xì)胞極化的影響。進行了熒光素酶報告基因測定和RNA免疫沉淀(RIP)，以揭示lncRNA BCRT1，miR-1303和PTBP3之間的相互作用。染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)和RT-PCR用于評估缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)對lncRNA BCRT1的調(diào)節(jié)作用。最終，揭示了一種新的HIF-1α/ lncRNA BCRT1 / miR-1303 / PTBP3通路，可促進乳腺癌的進展，并提示lncRNA BCRT1可能是乳腺癌的潛在生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。
M1檢測marker(CD80，MCP-1，iNOS和IL-6)
M2檢測marker(CD206和MRC-2)
外泌體檢測marker(CD63，HSP70和HSP90)
上皮檢測biomarker(E-cadherin)
間充質(zhì)檢測biomarker(Fibronectin，N-cadherin和Vimentin)
技術(shù)路線:
1.通過比對數(shù)據(jù)庫中的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達LncRNA BCRT1
2.組織和細(xì)胞系對LncRNA BCRT1的表達進行檢測
3.對LncRNA BCRT1在乳腺癌中的功能和機制進行研究
4.通過數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)LncRNA BCRT1的潛在靶點miR-1303
5.熒光素酶實驗對LncRNA BCRT1和miR-1303結(jié)合位點進行驗證
6.miR-1303的功能驗證，及LncRNA BCRT1和miR-1303見的機制研究
7.通過數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)miR-1303的潛在靶點PTBP3
8.熒光素酶實驗對miR-1303和PTBP3結(jié)合位點進行驗證
9.數(shù)據(jù)庫分析PTBP3表達量
10.PTBP3的機制和功能的檢測
11.lncRNA BCRT1是否經(jīng)過外泌體促進腫瘤轉(zhuǎn)移
12.外泌體lncRNA BCRT1對巨噬細(xì)胞極化的影響
13.LncRNA BCRT1和缺氧的關(guān)系驗證
14.LncRNA BCRT1的靶基因PTBP3與缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的關(guān)系
研究結(jié)果:
一、LncRNA BCRT1表達在乳腺癌中上調(diào)并與不良預(yù)后相關(guān)
lncRNA BCRT1在乳腺癌中被上調(diào)，而lncRNA BCRT1的高表達與乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)。
二、LncRNA BCRT1促進乳腺癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長
lncRNA BCRT1可以在體外和體內(nèi)促進乳腺癌細(xì)胞的增殖。
三、LncRNA BCRT1促進乳腺癌細(xì)胞的移動性和腫瘤轉(zhuǎn)移
四、LncRNA BCRT1在乳腺癌細(xì)胞中起miR-1303海綿的作用
據(jù)報道，許多l(xiāng)ncRNA在調(diào)節(jié)miRNA的表達和生物學(xué)功能中起競爭內(nèi)源性RNA(ceRNA)的作用。研究決定，該研究選擇miR-1303作為lncRNA BCRT1的抑制靶標(biāo)，以進一步研究乳腺癌。
五、LncRNA BCRT1通過抑制miR-1303上調(diào)PTBP3表達
使用miRDB，miRWalk，miRPathDB和TargetS-can數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)PTBP3是miR-1303的潛在靶標(biāo)。經(jīng)表明，PTBP3充當(dāng)乳腺癌的腫瘤啟動子，而lncRNA BCRT1通過調(diào)節(jié)miR-1303在調(diào)節(jié)PTBP3的表達中起著重要作用。
六、外泌體lncRNA BCRT1促進M2表型極化并增強巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤進展
先前的研究已經(jīng)報道，被認(rèn)為具有M2樣表型的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)是腫瘤微環(huán)境(TME)中最豐富的免疫相關(guān)細(xì)胞，并通過介導(dǎo)血管生成，轉(zhuǎn)移和免疫來參與腫瘤發(fā)展。我們評估了lncRNA BCRT1，M1標(biāo)記和M2標(biāo)記在非極化巨噬細(xì)胞，LPS /INF-γ誘導(dǎo)的M1巨噬細(xì)胞和IL-4 / IL-13誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞中的表達。然后，我們試圖研究介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的通信的機制。各種研究報道，lncRNAs可以被外泌體轉(zhuǎn)移以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境。這些結(jié)果表明lncRNA BCRT1可以通過外泌體轉(zhuǎn)移，從而促進M2表型極化并增強其腫瘤促進功能。
七、低氧條件下LncRNA BCRT1受HIF-1α轉(zhuǎn)錄調(diào)控
缺氧是各種癌癥的主要腫瘤內(nèi)特征之一，一些研究表明，癌癥的低氧微環(huán)境可能是某些lncRNA異常表達的原因。為了研究lncRNA BCRT1是否為缺氧敏感的lncRNA，及一系列的相關(guān)機制，乳腺癌細(xì)胞經(jīng)過缺氧或常氧處理48小時。研究結(jié)果表明，低氧通過與啟動子上的HRE1直接結(jié)合而由HIF-1α轉(zhuǎn)錄調(diào)控lncRNA BCRT1的表達。
八、LncRNA BCRT1介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞惡性特性
缺氧是腫瘤微環(huán)境的標(biāo)志，并與多種實體瘤的增殖，轉(zhuǎn)移和耐藥性有關(guān)。通過缺氧處理研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA BCRT1可能參與缺氧誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能。
結(jié) 論:
1.LncRNA-BCRT1通過與miR-1303競爭性結(jié)合發(fā)揮腫瘤啟動子的作用，保護PTBP3不被降解，從而促進乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)外的生長和進展。
2.lncRNA-BCRT1可以通過外泌體轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞中，促進M2極化，增強其對腫瘤進展的作用。
3.lncRNA-BCRT1是通過HIF-1α依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)控在缺氧條件下誘導(dǎo)的，從而促進了缺氧誘導(dǎo)的EMT。
4.研究結(jié)果為乳腺癌的轉(zhuǎn)移機制提供了新的見解，為乳腺癌的治療提供了一個有希望的靶點。