肝星狀細(xì)胞自噬抑制EV釋放改善肝纖維化

研究背景:
    自噬是真核生物的一種降解過(guò)程，稱為自噬體的雙膜小泡與溶酶體融合以降解胞漿蛋白和細(xì)胞器。自噬有助于肝內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，其調(diào)節(jié)失調(diào)與一些慢性肝臟疾病有關(guān)。在肝細(xì)胞中，自噬已被證明具有保護(hù)作用，而在肝星狀細(xì)胞(HSCs)中，自噬被提出通過(guò)脂噬(一種選擇性的脂滴降解)誘導(dǎo)其激活。然而，自噬抑制劑雷帕霉素靶點(diǎn)(mTOR)促進(jìn)星狀細(xì)胞的活化和肝纖維化。因此，破譯自噬參與的纖維化信號(hào)放大微調(diào)機(jī)制將提高我們對(duì)肝纖維化的理解。
    在肝臟中，受損肝細(xì)胞和竇狀內(nèi)皮細(xì)胞(LSECs)產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡(EVs)可誘導(dǎo)HSC的活化和遷移。有趣的是，肝損傷后EV釋放增加，而自噬抑制或溶酶體降解抑制與EV釋放增加有關(guān)。然而，自噬如何調(diào)節(jié)前纖維化的HSC來(lái)源的EV的生物發(fā)生，目前仍缺乏了解。
    在本研究中，作者證明了HSCs通過(guò)mTOR抑制自噬和激活RHOR相關(guān)蛋白激酶1 (ROCK1)信號(hào)來(lái)釋放EV。此外，這種EV釋放機(jī)制參與了肝纖維化進(jìn)程。 總之，HSC自噬通過(guò)減少纖維化HSC來(lái)源的EV釋放來(lái)減輕肝纖維化。本文于2020年5月7日發(fā)表在Journal of Hepatology（IF：18.946）雜志上。
結(jié) 果：
1、PDGF抑制自噬，增加EV釋放
    首先驗(yàn)證假設(shè)，在HSCs中，PDGF刺激模型抑制自噬以增加EV釋放。用mCherry-eGFP-LC3b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX2細(xì)胞(人肝星狀細(xì)胞系)，用自噬降解抑制劑bafilomycin A1或PDGF處理LX2細(xì)胞。正如預(yù)測(cè)的，與載體(圖1A左)相比，bafilomycin A1處理增加了eGFP+-mCherry+自噬體池(黃色)(圖1A中)，導(dǎo)致黃/紅比例增加(圖1A圖)，提示自噬抑制。與bafilomycin A1相似，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基比較，PDGF在處理4h時(shí)提高了黃/紅比例(圖1A右)，首次證明PDGF抑制自噬降解。
    與這些結(jié)果一致，PDGF處理導(dǎo)致人肝星狀細(xì)胞的自噬體LC3b和sequestosome-1 (p62) 蛋白質(zhì)含量增加，但PDGF并沒(méi)有增加LC3b或p62 mRNA水平(圖1B，右)，這表明蛋白質(zhì)水平的增加是由于自噬降解的減少，而不是由于p62和LC3b的重新轉(zhuǎn)錄表達(dá)。PDGF介導(dǎo)的自噬抑制與原代HSC細(xì)胞MVB池的CD63+增加（圖1C），以及人和小鼠HSC細(xì)胞來(lái)源的EV釋放的增加相關(guān)(圖1 d- e)。PDGF的關(guān)鍵下游信號(hào)分子之一是SHP2，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑SHP099抑制SHP2，消除PDGF介導(dǎo)的EV釋放(圖1D)。SHP099還降低了LC3b蛋白水平(圖1F)，表明SHP2抑制促進(jìn)了自噬降解。這些結(jié)果支持了HSCs中PDGF信號(hào)抑制自噬并增加EV釋放的觀點(diǎn)，提示自噬可能抑制EV釋放。

2、EV釋放受自噬激活因子REDD1調(diào)控
    使用PDGF/SHP2模型進(jìn)一步研究自噬如何抑制纖維性EV釋放。為此，用PDGF+/-SHP099處理人原發(fā)性HSCs，然后全轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序檢測(cè) (圖2)。近25%的基因被SHP099上調(diào)(圖2A)。結(jié)果得到REDD1，REDD1是mTOR的內(nèi)源性抑制劑，是SHP2的首要靶點(diǎn)之一。在對(duì)照和PDGF處理和siRNA敲除SHP2均導(dǎo)致REDD1上調(diào)（圖2B）。 這些結(jié)果表明，PDGF和SHP2負(fù)調(diào)控mTOR抑制劑和自噬激活劑REDD1的表達(dá)，提示REDD1在EV釋放中的作用。
   接下來(lái)，通過(guò)刺激REDD1的表達(dá)來(lái)了解REDD1在肝纖維化和HSC衍生的EV釋放中的作用。使用REDD1刺激物 CoCl2（圖2C，左）。在EV或PDGF存在下，用CoCl2處理原代人HSC。REDD1表達(dá)減弱了PDGF介導(dǎo)的EV釋放（圖2C，中間），而對(duì)EV大小沒(méi)有影響（圖2C，右）。接下來(lái)，我們?cè)贚X2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)REDD1（圖2D，左）。REDD1的過(guò)表達(dá)顯著降低了HSC衍生的EV釋放（圖2D，右）。 總之，這些結(jié)果表明，REDD1是一種自噬激活劑和mTOR抑制劑，是HSC來(lái)源的纖維化EV釋放的負(fù)調(diào)節(jié)劑。

3、mTOR信號(hào)通過(guò)抑制自噬和激活ROCK1來(lái)增加HSC誘導(dǎo)的EV釋放
    為了進(jìn)一步了解自噬如何影響纖維化EV釋放，研究了自噬抑制劑mTOR在HSC衍生的EV釋放中的作用。結(jié)果表明，雷帕霉素對(duì)mTOR的抑制作用減弱了PDGF介導(dǎo)的EV釋放，而對(duì)EV的大小沒(méi)有任何影響（圖3B）。 然后，在人HSC上進(jìn)行了mTOR結(jié)合蛋白沉默，mTOR的調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（Raptor）和mTOR雷帕霉素不敏感相關(guān)蛋白（Rictor）沉默（圖3C）。 與雷帕霉素結(jié)果一致，siRNA引起的mTOR敲除消除了PDGF介導(dǎo)的EV釋放（圖3D）。 Raptor或Rictor siRNA介導(dǎo)的敲低也獲得了類似的效果（圖3D），證實(shí)mTOR信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)EV釋放。

    接下來(lái)，研究了原代人HSC中mTOR依賴的EV釋放的起源。如圖PDGF增加了p62蛋白水平，該水平被雷帕霉素減弱（圖4A），表明PDGF通過(guò)mTOR抑制自噬。此外，通過(guò)bafilomycin A1（圖4B）造成的自噬抑制作用顯著增加了EV級(jí)分中的外泌體標(biāo)記物CD81以及微泡標(biāo)記物Alf6的表達(dá)。根據(jù)這些結(jié)果，作者研究了mTOR信號(hào)在原代人HSC中MVB的作用，其中CD63是MVB和外泌體標(biāo)記。用PDGF處理細(xì)胞可增加MVB，雷帕霉素可將其消除，如免疫熒光法所證實(shí)（圖4C）。與此相一致，雷帕霉素降低了PDGF介導(dǎo)的外泌體釋放，如EV中CD81和CD63蛋白水平的降低得以證明（圖4D）。這些結(jié)果表明，mTOR信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)外來(lái)體釋放。
    與外泌體相反，微泡釋放取決于ROCK1的活性。因此，接下來(lái)研究了mTOR信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)ROCK1活性和微泡釋放的影響。PDGF處理原發(fā)性人HSC細(xì)胞激活了ROCK1信號(hào)，表現(xiàn)為ROCK1下游信號(hào)分子，肌球蛋白磷酸酶靶標(biāo)亞基1（MYPT1）的磷酸化水平升高（圖4E）。通過(guò)用ROCK1抑制劑fasudil處理HSC可以消除這種情況（圖4E）。隨后，fasudil對(duì)ROCK1的抑制作用顯著降低了PDGF介導(dǎo)的EV釋放，如微泡標(biāo)志物Arf6和外泌體標(biāo)志物CD81表達(dá)下調(diào)，表明外泌體和微泡釋放機(jī)制之間存在相互影響。PDGF介導(dǎo)的ROCK1活性也被雷帕霉素抑制，如MYPT1磷酸化減弱（圖4F）表明PDGF通過(guò)mTOR誘導(dǎo)ROCK1活化。此外，雷帕霉素降低了PDGF介導(dǎo)的微泡釋放，這通過(guò)降低EV餾分中的Arf6蛋白水平來(lái)證明（圖4D）。這些數(shù)據(jù)表明，mTOR信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)微泡釋放。
總之，mTOR信號(hào)通過(guò)抑制MVB的自噬降解誘導(dǎo)外泌體釋放，并通過(guò)激活ROCK1信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)誘導(dǎo)微泡釋放，提供了對(duì)PDGF介導(dǎo)的纖維化EV釋放的機(jī)制的見(jiàn)解。

4、mTOR介導(dǎo)的EV誘導(dǎo)HSC細(xì)胞的體外遷移
    受體酪氨酸激酶（RTK）信號(hào)在纖維化中占據(jù)關(guān)鍵地位，因此我們利用磷酸化RTK蛋白陣列評(píng)估了EV含量。RTK陣列結(jié)果顯示，PDGF處理后的EV中存在幾種磷酸化的RTK，例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3（FGFR3），內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞激酶（Tie2），間變性淋巴瘤激酶（ALK）和受體酪氨酸激酶-孤兒受體1（ROR1）（圖5A）。受PDGF上調(diào)，被雷帕霉素降低最顯著的是磷酸FGFR3（圖5A），它參與成纖維細(xì)胞遷移。這些數(shù)據(jù)表明，mTOR信號(hào)不僅促進(jìn)了EV的釋放，而且還通過(guò)激活RTK介導(dǎo)EV的富集。由于以前已確定RTK與細(xì)胞遷移有關(guān)，所以接下來(lái)驗(yàn)證這些富含RTK的EV對(duì)HSC遷移的影響。與衍生自對(duì)照細(xì)胞的EV相比，衍生自PDGF處理的EV顯著增加了受體HSC的遷移（圖5C）?？傊?，這些結(jié)果表明，mTOR促進(jìn)了轉(zhuǎn)移前的RTK富集的EV的釋放。

5、體內(nèi)刪除HSC特異性SHP2肝纖維化下降
   由于SHP2是mTOR依賴性EV釋放的上游調(diào)節(jié)劑，在全肝裂解物中，與健康個(gè)體相比，肝硬化患者的SHP2升高（圖6A）。因此，驗(yàn)證HSC特異性SHP2缺失對(duì)肝纖維化建立的影響，由 CCl4 給藥6周誘導(dǎo)肝纖維化。然后收集肝臟，并用天狼星紅染色和WB進(jìn)行分析。如預(yù)期的那樣，慢性CCl4處理后同窩對(duì)照小鼠（SHP2f1 / f1）的肝膠原蛋白I，αSMA蛋白水平和天狼星紅染色增加（圖6B-C）。然而，如膠原蛋白I，αSMA和天狼星紅染色的蛋白質(zhì)水平所表明的，當(dāng)在HSC（SHP2ΔHSC小鼠）中選擇性刪除SHP2基因時(shí)，肝纖維化顯著減少?？傊?，HSCs中SHP2的選擇性缺失顯著減弱了肝纖維化。

6、HSC特異性 SHP2敲除的老鼠EV減少了WT老鼠中 CCl4介導(dǎo)的肝纖維化
    前文證明，由PDGF處理的HSC衍生的EV具有促纖維化作用，而SHP2對(duì)肝纖維化至關(guān)重要（圖6B-C）。因此，接下來(lái)研究HSC特異性SHP2如何影響循環(huán)EV的纖維化潛力，以及這些EV如何在體內(nèi)影響肝纖維化。與生理鹽水對(duì)照相比，橄欖油處理的SHP2fl / fl或SHP2ΔHSC供體小鼠的EV不會(huì)影響肝纖維化。 但是，如WB和Sirius red（圖6D-E）所示，來(lái)自經(jīng)CCl4處理的SHP2fl / fl對(duì)照小鼠的EV顯著增加了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化（圖6D-E），表明這些EV具有成纖維性。 此外，從CCl4處理的SHP2ΔHSC小鼠中分離出的EV顯著減少了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化（圖6D-E），這表明在HSC中選擇性刪除SHP2會(huì)降低EV的纖維化潛力。 總之，HSC中SHP2的選擇性缺失顯著減弱了循環(huán)EV的纖維化特性。

    總之，HSC中的SHP2通過(guò)抑制自噬，REDD1和激活mTOR途徑來(lái)增強(qiáng)纖維化電動(dòng)汽車的釋放，從而發(fā)揮其促纖維化作用。 SHP2-mTOR信號(hào)的抑制可能作為治療肝纖維化的新靶標(biāo)。