PGC1α抑制肝癌轉移

    PPARγ協(xié)同激活因子-1α（PGC1α）是線粒體生物發(fā)生和呼吸的關鍵調控因子。PGC1α參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和代謝狀態(tài)。然而，其在肝細胞癌（HCC）進展中的作用尚不清楚。今天小編為大家介紹發(fā)表于“Hepatology”的文章“PGC1α suppresses metastasis of HCC by inhibiting Warburg effect via PPARγ-dependent WNT/β-catenin/PDK1 axis”，帶大家了解其中的機制。

    在本研究中，我們觀察到PGC1α在人肝癌中下調。臨床研究表明，PGC1α的低表達與生存率低、血管侵犯和腫瘤體積大有關。PGC1α抑制肝癌細胞在體外和體內的遷移和侵襲。PGC1α通過下調WNT/β-catenin途徑介導的PDK1而抑制Warburg效應，PPARγ激活則抑制WNT/β-catenin途徑。
結 果：
1.PGC1α低表達與肝癌預后不良相關
    通過TCGA和GSE14520隊列分析，發(fā)現(xiàn)PGC1α在肝癌中下調（圖1A）。采用實時PCR技術檢測肝癌組織及癌旁非癌組織中PGC1α的表達水平。如圖1B-C所示，與相應的非腫瘤肝組織相比，腫瘤組織中PGC1α的mRNA水平降低了72.3%。western blot進一步證實了PGC1α的下調（圖1D）。接著，為探討PGC1α在肝癌組織中下調的臨床意義，對肝癌患者的組織芯片進行了免疫組化染色。PGC1α的代表性免疫染色如圖1E所示，根據免疫組化結果將肝癌患者分為兩組：PGC1α高表達組和PGC1α低表達組。Kaplan-Meier生存分析顯示，PGC1α表達水平低的肝癌患者總生存率（OS）和復發(fā)時間低于PGC1α水平高的患者（圖1F）?？傊?，這些數(shù)據表明PGC1α可能是預測肝癌患者預后的一個有價值的因素。

2.PGC1α抑制肝癌細胞體內外轉移
    為了探討PGC1α在肝癌細胞中的生物學功能，我們建立了PGC1α在HCCLM3和MHCC97H細胞系中高表達的穩(wěn)定模型，并根據PGC1α在肝癌細胞中的表達水平，建立了PGC1α在HepG2和SMMC7721細胞系中低表達的穩(wěn)定模型。遷移和侵襲試驗表明，PGC1α的過表達顯著抑制了HCC細胞的遷移和侵襲性（圖2A-B），而PGC1α的敲除顯著促進了HCC細胞的遷移和侵襲性（圖2C）。此外，為了在體內證實上述發(fā)現(xiàn)，我們將穩(wěn)定的細胞株注入裸鼠的側尾靜脈，建立肺轉移模型。8周后，與對照組相比，注射PGC1α高表達HCCLM3細胞的小鼠肺轉移結節(jié)較少（圖2D）。相反，PGC1α的敲除顯著增加了肺轉移結節(jié)的數(shù)量（圖2E）。此外，與對照組相比，PGC1α的穩(wěn)定過表達顯著降低了原位肝癌種植模型中肝內轉移灶的數(shù)量（圖2F）。相反，PGC1α敲除增加了肝內和肺轉移結節(jié)的數(shù)量。這些結果提示PGC1α在體內外均能抑制肝癌細胞的遷移和侵襲，可能在肝癌的發(fā)展和轉移中起到抑癌作用。

3.PGC1α通過調節(jié)Warburg效應抑制肝癌的進展
    據報道，PGC1α在幾種癌癥的發(fā)展過程中參與了重編程代謝。我們假設肝癌細胞中PGC1α的抑瘤活性伴隨著一個整體的代謝重編程。我們比較了PGC1α高表達或基因敲除的肝癌細胞和對照細胞之間的關鍵細胞代謝和生物能量參數(shù)。結果表明，PGC1α的過表達顯著提高了HCCLM3和MHCC97H細胞的基礎耗氧率和最大耗氧率（OCR），降低了細胞外酸化率（ECAR）（圖3A）。相反，PGC1α的敲除降低HepG2和SMMC7721細胞的OCR和ECAR（圖3B）。此外，PGC1α的過表達導致細胞ATP水平、葡萄糖攝取量的增加以及細胞外乳酸水平的降低（圖3C），而PGC1α的敲除降低了細胞內ATP水平和葡萄糖攝取量，并增加了細胞外乳酸水平（圖3D）接著，為了探討Warburg效應是否與HCC細胞的進展有關，HCCLM3載體和HepG2-shPGC1α細胞分別用不同濃度的2-DG處理，結果顯示2-DG對HCCLM3載體和HepG2-shPGC1α細胞的糖酵解有明顯的抑制作用。HCCLM3載體和HepG2-shPGC1α細胞的遷移和侵襲能力也呈劑量依賴性下降（圖3E）。最后，為了進一步探討PGC1α調節(jié)有氧糖酵解的機制，我們評估了PGC1α對重要糖酵解酶表達的影響。我們用RT-PCR檢測了13種糖酵解酶的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)除PDK1和乳酸脫氫酶（LDHA）外，大多數(shù)酶的表達水平沒有改變，PDK1的表達水平也基本改變（圖3F）。糖異生、氧化磷酸化和肝臟特異性葡萄糖轉運蛋白的標記物也通過RT-PCR進行測量（圖3G）。綜上所述，這些結果提示PDK1是PGC1α調節(jié)有氧糖酵解的功能下游靶點，對PGC1α介導的腫瘤進展至關重要。

4.PGC1α對PDK1的抑制作用是由WNT/β-catenin信號轉導介導的
    我們研究了PGC1α抑制PDK1的機制。通過RNA-seq評估HCCLM3細胞的整體基因表達模式（圖4A）。通過基因集富集分析（GSEA）研究轉錄組變化對生物功能和途徑的影響。我們發(fā)現(xiàn)WNT信號通路與HCCLM3細胞中的PGC1α顯著負相關（圖4B）。采用TOP/FOPFLASH報告分析PGC1α表達對肝癌細胞WNT/β-catenin通路的影響。我們發(fā)現(xiàn)PGC1α的過表達顯著抑制了HCCLM3細胞中β-catenin的轉錄活性，而PGC1α敲除后HepG2細胞中TOPFLASH報告活性顯著增強（圖4B）。WNT/β-catenin信號轉導通過PDK1促進結腸癌細胞有氧糖酵解。因此，我們在WNT/β-連環(huán)蛋白途徑抑制劑XAV-939或ICG-001存在下檢測PDK1和β-連環(huán)蛋白的水平。如圖4C和D所示，XAV-939或ICG-001逆轉了HCCLM3載體和HepG2-shPGC1α細胞中PDK1的mRNA和蛋白水平的升高。Pyruvate dehydrogenase（pSer293 PDH）作為PDK1的靶點，其升高水平也被WNT/β-catenin途徑抑制劑抑制。β-catenin蛋白水平隨著PGC1α的過表達而降低，隨著PGC1α的敲除而升高。因此，XAV-939和ICG-001均能抑制HCCLM3載體和HepG2-shPGC1α細胞ECAR和乳酸生成的增強水平（圖4E-4F）。這些數(shù)據表明PGC1α通過抑制WNT/β-catenin信號通路抑制肝癌細胞PDK1的表達。

5.PPARγ對PGC1α誘導的WNT/β-catenin通路的抑制和肝癌細胞Warburg效應的影響
    PPARγ誘導典型WNT/β-catenin途徑的抑制，促進葡萄糖穩(wěn)態(tài)。因此，我們探究PGC1α誘導的WNT/β-catenin信號抑制和抗Warburg效應是否是通過PPARγ依賴方式介導的。雙熒光素酶報告分析顯示，PGC1α過表達的HCCLM3和MHCC97H細胞中PPARγ的轉錄活性顯著上調（圖5A）。采用TOP/FOPFLASH報告分析PPARγ對PGC1α過表達誘導的HEK293T細胞WNT/β-catenin通路的抑制作用。PPARγ基因敲除逆轉PGC1α誘導的WNT/β-catenin信號傳導抑制（圖5B）。這表明PGC1α對肝癌細胞WNT/β-catenin信號傳導的抑制作用依賴于PPARγ。
    接下來，我們探討PPARγ如何介導PGC1α誘導的肝癌WNT/β-catenin通路的抑制。結果表明，PGC1α即使在CHX存在的情況下也能降低β-catenin蛋白的水平（圖5C，左），表明β-catenin的衰減是一種翻譯后機制。然后，用蛋白酶體抑制劑MG-132處理HCCLM3細胞，我們發(fā)現(xiàn)PGC1α介導的β-連環(huán)蛋白降解被MG-132拮抗（圖5C，右），這表明PGC1α介導的β-連環(huán)蛋白降解是由HCC細胞中的蛋白酶體介導的途徑引起的。此外，通過PPARγ基因敲除，PGC1α誘導的總β-連環(huán)蛋白和核β-連環(huán)蛋白下調被減弱（圖5D）。這表明PGC1α誘導β-catenin降解依賴于PPARγ。
    為了探討PGC1α誘導的抗Warburg作用是否依賴于肝癌細胞中的PPARγ，我們用PPARγ抑制劑GW9662治療肝癌細胞。如預期的那樣，GW9662逆轉了肝癌細胞中PGC1α過表達引起的ECAR下降（圖5E）。PPARγ的敲除逆轉了PGC1α介導的β-catenin、PDK1和pSer293 PDH的下調（圖5D），以及細胞外乳酸水平的降低（圖5F）。此外，PPARγ激動劑吡格列酮治療顯著抑制PGC1α基因敲除組在體內外的腫瘤進展（圖5G）。這些數(shù)據表明PPARγ通過增加β-catenin在肝癌細胞中的降解，介導PGC1α誘導的WNT/β-catenin信號傳導抑制和腫瘤進展。

6.肝癌組織中PGC1α與PDK1呈負相關
    為了探討PDK1在HCC中的預后價值，我們分析了肝癌手術切除患者中PGC1α和PDK1的表達。肝細胞癌組織中PGC1α和PDK1的代表性照片如圖6A所示。PGC1α高表達的肝細胞癌組織中PDK1的染色較弱，而PGC1α低表達的肝細胞癌組織中PDK1的染色較強。我們分析了肝癌組織中PGC1α表達與PDK1表達的關系。PGC1α表達與PDK1表達顯著負相關（圖6B）。我們還分析了肝癌組織中PGC1α和PDK1表達水平的預后價值。Kaplan-Meier分析顯示PGC1α高表達和PDK1低表達的肝癌患者OS最高，復發(fā)率最低（圖6C）。這些結果提示PDK1在PGC1α介導的肝癌進展中起作用。

結 論：
    我們研究了PGC1α在肝癌轉移和代謝中的作用及其機制。PGC1α通過抑制WNT/β-catenin途徑下游靶點PDK1的有氧糖酵解抑制肝癌細胞的體內外轉移。PGC1α對WNT/β-catenin通路的抑制作用依賴于PPARγ。我們的發(fā)現(xiàn)闡明了PGC1α作用的新見解，并提示PGC1α可能是肝癌新治療策略的一個有希望的靶點。