外泌體circRNA參與腫瘤免疫治療

     外泌體，circRNA，腫瘤免疫微環(huán)境和腫瘤免疫治療的都是近年來生命科學(xué)研究熱點(diǎn)，也是國自然基金申請(qǐng)重點(diǎn)領(lǐng)域。今天我們講一篇2020年6月27日發(fā)表在Molecular Cancer的文章，題名：Cancer Cell-Derived Exosomal circUHRF1 Induces Natural Killer Cell Exhaustion and May Cause Resistance to anti-PD1 Therapy in Hepatocellular Carcinoma。這篇文章來自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院研究團(tuán)隊(duì)，文章主要講述了外泌體circUHRF1主要由HCC細(xì)胞分泌，通過誘導(dǎo)HCC中的NK細(xì)胞功能障礙參與免疫抑制，CircUHRF1可能驅(qū)動(dòng)抗PD1免疫療法的耐藥性。

技術(shù)路線:

結(jié) 果：
1.肝癌組織中與UHRF1相關(guān)的circRNA的分析
    具有PHD和RING指域1（UHRF1）的泛素樣蛋白是參與調(diào)節(jié)DNA甲基化的關(guān)鍵分子，通常在包括HCC在內(nèi)的許多癌癥中過表達(dá)。UHRF1過表達(dá)可促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展。因此，作者推測(cè)UHRF1衍生的circRNA表達(dá)可能被上調(diào)并可能促進(jìn)HCC的進(jìn)展。
    qRT-PCR檢測(cè)從UHRF1衍生的14個(gè)circRNA的表達(dá)水平，qRT-PCR又檢測(cè)circUHRF1在240例HCC組織和癌旁的表達(dá)，肝癌組織高表達(dá)。circUHRF1 高表達(dá)的HCC患者腫瘤較大并血液中的NK細(xì)胞比例降低，微血管轉(zhuǎn)移增多。KM生存分析表明circUHRF1 高表達(dá)患者的臨床預(yù)后較差。數(shù)據(jù)表明，HCC細(xì)胞中circUHRF1表達(dá)上調(diào)與患者不良預(yù)后相關(guān)，并表明circUHRF1表達(dá)增加可能與HCC的進(jìn)展有關(guān)。

2.HCC細(xì)胞以外泌體方式分泌circUHRF1
    從HCC細(xì)胞系上清液中分離了外泌體，并通過TEM和Western blot對(duì)其進(jìn)行了評(píng)估。在6個(gè)HCC細(xì)胞系及對(duì)應(yīng)的外泌體中進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)， HCCLM3和SMMC-7721細(xì)胞系中circUHRF1顯著上調(diào)，且外泌體中circUHRF1的表達(dá)趨勢(shì)與親代細(xì)胞的一致。與健康供體相比，HCC患者的血漿外泌體circUHRF1水平升高。腫瘤切除后血漿外泌體circUHRF1水平降低，而在腫瘤復(fù)發(fā)患者中升高，這表明血漿外泌體circUHRF1主要由HCC細(xì)胞產(chǎn)生。有免疫逃逸的患者血漿中外泌體circUHRF1水平顯著升高，外周血中NK細(xì)胞比例降低。這些數(shù)據(jù)表明血漿外泌體circUHRF1可以作為NK細(xì)胞相關(guān)的免疫逃逸的關(guān)鍵分子。

3.HCC細(xì)胞通過外泌體circUHRF1抑制NK細(xì)胞功能
    將來自健康供體的NK細(xì)胞與HCCLM3和SMMC-7721細(xì)胞以1：1的比例共培養(yǎng)24h。與NK細(xì)胞相比， SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞共培養(yǎng)的NK細(xì)胞在隨后與K562細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出IFN-γ和TNF-α分泌的顯著降低。SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞共培養(yǎng)的NK細(xì)胞中circUHRF1表達(dá)顯著增加，并受到外泌體抑制劑GW4869的抑制，抑制劑GW4869處理后IFN-γ和TNF-α表達(dá)恢復(fù)正常水平。使用shRNA慢病毒載體構(gòu)建HCCLM3和SMMC-7721 circUHRF1敲低細(xì)胞。在circUHRF1敲低細(xì)胞中外泌體circUHRF1的表達(dá)顯著降低，外泌體circUHRF1水平的降低有效減弱了HCC衍生的外泌體誘導(dǎo)的NK細(xì)胞中IFN-γ和TNF-α分泌的損傷。結(jié)果表明，源自HCC的外泌體circUHRF1損害NK細(xì)胞的功能。

4.CircUHRF1和miR-449c-5p在NK細(xì)胞中相互作用
    通過StarBase v3.0分析，預(yù)測(cè)有14個(gè)miRNAs可能是circUHRF1的靶標(biāo)。使用circUHRF1特異性探針進(jìn)行circRNA免疫沉淀（circRIP），并使用qRT-PCR檢測(cè)到了與circUHRF1形成復(fù)合體的14種預(yù)測(cè)miRNA。與對(duì)照相比，circUHRF1和miR-449c-5p顯著富集，而其他miRNA沒有富集或僅有少量富集。在NK-92細(xì)胞中進(jìn)行了AGO2-RIP實(shí)驗(yàn)，抗AGO2抗體顯著富集了circUHRF1和miR-449c-5p，pulldown和熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證這一結(jié)果。在NK-92細(xì)胞中過表達(dá)miR-449c-5p后，circUHRF1的水平顯著降低，而在circUHRF1過表達(dá)后，miR-449c-5p的水平顯著降低。結(jié)果證實(shí)，circUHRF1是miR-449c-5p分子海綿，且在在NK細(xì)胞中相互影響。miR-449c-5p的過表達(dá)表達(dá)顯著抑制腫瘤活性（促進(jìn)IFN-γ和TNF-α分泌），增加circUHRF1表達(dá)可顯著抑制miR-449c-5p的腫瘤抑制功能，證明了了HCC衍生的外泌體circUHRF1可能通過miR-449c-5p相關(guān)途徑抑制NK細(xì)胞功能的關(guān)鍵能力。

5.CircUHRF1通過抑制miR-449c-5p活性上調(diào)TIM-3表達(dá)
    StarBase v3.0預(yù)測(cè)了miR-449c-5p在TIM-3上的結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果。miR-449c-5p的過表達(dá)后TIM-3表達(dá)顯著降低?；貜?fù)實(shí)驗(yàn)表明miR-449c-5p過表達(dá)導(dǎo)致TIM-3的mRNA和蛋白表達(dá)降低，而circUHRF1逆轉(zhuǎn)了miR-449c-5p對(duì)TIM-3表達(dá)的抑制作用。接下來調(diào)查了40例HCC患者外周血NK細(xì)胞中circUHRF1和miR-449c-5p / TIM-3表達(dá)之間的相關(guān)性。外周血NK細(xì)胞中circUHRF1表達(dá)與miR-449c-5p表達(dá)負(fù)相關(guān)，且與TIM-3 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，miR-449c-5p表達(dá)與外周NK細(xì)胞中TIM-3 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。表明外泌體circUHRF1的上調(diào)消除了miR-449c-5p對(duì)NK細(xì)胞中TIM-3的腫瘤抑制作用。

6.CircUHRF1以NK細(xì)胞依賴性方式誘導(dǎo)HCC進(jìn)展
    使用慢病毒載體在PLC / PRF / 5細(xì)胞中構(gòu)建circUHRF1過表達(dá)細(xì)胞系。結(jié)果顯示過表達(dá)成功，且外泌體中circUHRF1表達(dá)升高。使用上述細(xì)胞進(jìn)行裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建（注射健康供體的NK細(xì)胞），過表達(dá)circUHRF1的PLC / PRF / 5細(xì)胞轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)顯著增加，轉(zhuǎn)移小鼠的血清外泌體circUHRF1水平升高，轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)中NKG2D陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。這些結(jié)果表明circUHRF1以外泌體和NK細(xì)胞依賴性方式促進(jìn)HCC進(jìn)展。

7.CircUHRF1增強(qiáng)HCC對(duì)抗PD1治療的抵抗力
    作者分析了30例接受抗PD1免疫治療的復(fù)發(fā)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（包括肺轉(zhuǎn)移）的HCC患者的回顧性數(shù)據(jù)，這些患者在免疫治療前2-36個(gè)月接受了肝切除術(shù)。六個(gè)治療周期后，使用CT評(píng)估療效。結(jié)果顯示，部分緩解（PR）3例，疾病穩(wěn)定（SD）7例，進(jìn)行性疾病（PD）20例。測(cè)量circUHRF1的表達(dá)顯示，PD組的circUHRF1的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于SD和PR組。為了進(jìn)一步探討circUHRF1與免疫逃避之間的關(guān)系，檢查了30例HCC患者組織中NKG2D的表達(dá)。與易受PD1治療的HCC患者相比，抗PD1治療的HCC患者的NKG2D陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，HCC組織中circUHRF1表達(dá)與NKG2D陽性細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一步評(píng)估circUHRF1對(duì)抗PD1治療的抗性，通過皮下植入circUHRF1基因敲除的HCCLM3細(xì)胞建立了異種移植模型。circUHRF1敲低細(xì)胞可提高對(duì)抗PD1治療的敏感性并提高總生存率。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明過表達(dá)circUHRF1可能會(huì)阻礙HCC對(duì)抗PD1治療的反應(yīng)，而靶向circUHRF1可能是恢復(fù)HCC對(duì)抗PD1治療敏感性的有前途和有效的方法。

結(jié) 論:
    HCC衍生的外泌體通過誘導(dǎo)NK細(xì)胞上TIM-3表達(dá)來抑制IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生。腫瘤外泌體通過circUHRF1抑制NK細(xì)胞功能，為HCC細(xì)胞與NK細(xì)胞之間的串?dāng)_提供了新證據(jù)。

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