CK1α/CBX4軸在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中的作用

    骨肉瘤是一種侵襲性惡性腫瘤，肺轉(zhuǎn)移率高，缺乏治療靶點(diǎn)。骨肉瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)患者的治療策略的確定是必要和緊迫的。因此，更好地了解骨肉瘤發(fā)生的分子機(jī)制和識(shí)別骨肉瘤的治療靶點(diǎn)是迫切的研究目標(biāo)。接下來(lái)小編為大家?guī)?lái)發(fā)表于“nature communications”上的文章“Targeting the CK1α/CBX4 axis for metastasis in osteosarcoma”。

    在這里，我們報(bào)道了在骨肉瘤細(xì)胞系和組織中過(guò)表達(dá)的染色體盒同源物4（CBX4）。CBX4通過(guò)向Runx2啟動(dòng)子募集GCN5，通過(guò)轉(zhuǎn)錄上調(diào)Runx2促進(jìn)骨肉瘤轉(zhuǎn)移。CK1α通過(guò)抑制CBX4抑制細(xì)胞遷移和侵襲。骨肉瘤組織中CK1α與CBX4呈負(fù)相關(guān)，CK1α是預(yù)測(cè)骨肉瘤轉(zhuǎn)移患者臨床預(yù)后的重要指標(biāo)。恩波吡維銨（PP）作為CK1α的選擇性激活劑，可通過(guò)CK1α/CBX4軸抑制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移。
結(jié)果：
1）CBX4通過(guò)轉(zhuǎn)錄上調(diào)Runx2發(fā)揮作用
    我們通過(guò)測(cè)序和qPCR確定骨肉瘤發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵分子為CBX4。敲除CBX4可減少U2OS、U2OS/MTX300和HOS細(xì)胞的遷移和侵襲（圖1a-c、g-i）。在穩(wěn)定表達(dá)CBX4的細(xì)胞中，細(xì)胞遷移和侵襲持續(xù)增強(qiáng)（圖1d-f，j-l）。
    Runx2在促進(jìn)骨肉瘤轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。因此，我們好奇CBX4是否能影響骨肉瘤中Runx2的轉(zhuǎn)錄。敲除CBX4后，Runx2的蛋白質(zhì)和mRNA水平降低，而CBX4的過(guò)表達(dá)增加了U2OS、U2OS/MTX300和HOS細(xì)胞中Runx2的蛋白質(zhì)和mRNA水平（圖1a-f，m，n）。然而，CDM-CBX4的色域突變體在mRNA和蛋白質(zhì)水平上都不能增加Runx2，無(wú)論是遷移還是侵襲（圖1o-q），總之，這些結(jié)果表明CBX4在調(diào)節(jié)Runx2以及骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中起著重要作用。

2）在骨肉瘤細(xì)胞中，CBX4通過(guò)招募GCN5到Runx2啟動(dòng)子來(lái)增加Runx2
    敲低或過(guò)表達(dá)CBX4可以分別抑制和增加Runx2啟動(dòng)子活性（圖2a，b）。當(dāng)使用p16（INK4a/ARF）啟動(dòng)子作為陽(yáng)性對(duì)照，基于染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析，CBX4與Runx2 P2啟動(dòng)子相連（圖2c）。以RNA聚合酶II（Pol II）為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)敲除U2OS和U2OS/MTX300細(xì)胞中的CBX4，H3K27Ac與Runx2啟動(dòng)子的關(guān)聯(lián)受到損害（圖2d，e）Co-IP顯示CBX4在外源和內(nèi)源水平上與P300、CBP或GCN5結(jié)合，但與TIP60和PCAF均不結(jié)合（圖2f）。另外，沉默GCN5消除了CBX4過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的mRNA和蛋白質(zhì)水平的Runx2增加（圖2g，h）。此外，CBX4基因敲除不僅消除了GCN5對(duì)Runx2啟動(dòng)子活性的增強(qiáng)（圖2i，j），而且還減少了GCN5與Runx2啟動(dòng)子的結(jié)合（圖2d，e）。Runx2的過(guò)表達(dá)則逆轉(zhuǎn)了敲除CBX4引起的細(xì)胞遷移和侵襲的抑制（圖2k），而內(nèi)源性Runx2的缺失則消除了CBX4過(guò)表達(dá)引起的遷移和侵襲的增強(qiáng)（圖2l），表明CBX4對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響取決于Runx2。此外，Runx2的額外損耗不能進(jìn)一步減少CBX4敲除細(xì)胞的遷移和侵襲（圖2m）。總之，這些結(jié)果表明CBX4通過(guò)向骨肉瘤細(xì)胞中的Runx2啟動(dòng)子招募GCN5來(lái)增強(qiáng)Runx2的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。

3）CHIP是負(fù)責(zé)CBX4泛素化和降解的E3連接酶
    我們之前的數(shù)據(jù)表明，CBX4 C末端的10個(gè)氨基酸可能對(duì)其蛋白穩(wěn)定性至關(guān)重要，而如上圖所示，CBX4促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。我們?cè)噲D通過(guò) MS分析，鑒定負(fù)責(zé)降解CBX4的E3連接酶。CBX4相互作用蛋白中有三種著名的E3連接酶：TRIM21、MKRN2和CHIP（圖3a）。然而，在外源和內(nèi)源水平（圖3b）下，CBX4蛋白水平僅通過(guò)CHIP而不是TRIM21或MKRN2降低，而通過(guò)siRNA或shRNA敲除CHIP可提高細(xì)胞內(nèi)CBX4蛋白水平（圖3c）。此外，野生型CHIP降低了蛋白水平，增強(qiáng)了CBX4的泛素化，縮短了半衰期（圖3d-f），而siRNA敲除CHIP則降低了CBX4的泛素化，延長(zhǎng)了半衰期（圖3g，h）。一致地，CHIP和CBX4之間的相互作用已經(jīng)在其外源和內(nèi)源水平上被檢測(cè)到（圖3i）。這些結(jié)果表明，CHIP是導(dǎo)致CBX4泛素化和蛋白酶體/溶酶體降解的E3連接酶。
    為了進(jìn)一步鑒定CHIP誘導(dǎo)的CBX4泛素化位點(diǎn)，制備了一組CBX4片段。如圖3j所示，在K178/280A突變株中，CHIP誘導(dǎo)的CBX4泛素化幾乎被消除，而在K178A或K280A突變株中，CBX4的泛素化部分被減弱。為支持這些發(fā)現(xiàn)，與野生型CBX4相比，這三個(gè)突變株對(duì)CHIP降解的抗性更強(qiáng)（圖3k）。這些結(jié)果表明CBX4的K178和K280是CHIP泛素化的關(guān)鍵位點(diǎn)。

4）CK1α在T437處磷酸化CBX4，促進(jìn)其轉(zhuǎn)化
    一般來(lái)說(shuō)，CHIP介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解是由其自身或其底物的磷酸化調(diào)節(jié)的。T437突變體影響CHIP介導(dǎo)的CBX4泛素化和降解（圖4a，b），強(qiáng)烈表明T437可能是泛素介導(dǎo)的CBX4降解所需的顯性磷酸化位點(diǎn)。
    CBX4和CK1α之間的相互作用在細(xì)胞的外源和內(nèi)源水平上都被檢測(cè)到（圖4c，d）。此外，CK1α降低了野生型CBX4的蛋白質(zhì)水平，但沒(méi)有降低其T437A突變體的蛋白質(zhì)水平（圖4e）。使用抗-T437抗體，當(dāng)CBX4在T437磷酸化時(shí)，抗體能特異性地識(shí)別CBX4，通過(guò)在細(xì)胞中與CK1α共轉(zhuǎn)染來(lái)增加T437處CBX4的磷酸化；在體外與純化的V5-CK1α孵育后，CBX4在T437處的磷酸化作用也增加了，但其T437A突變體沒(méi)有增加（圖4f，4g）。此外，在U2OS/MTX300細(xì)胞中，CK1α的敲除和過(guò)表達(dá)分別降低和增強(qiáng)了T437處內(nèi)源性CBX4的磷酸化，表明T437處內(nèi)源性CBX4的磷酸化也依賴于CK1α（圖4h，i）。
    接下來(lái)，我們?cè)噲D檢測(cè)CK1α對(duì)T437處CBX4的磷酸化是否與骨肉瘤的進(jìn)展有關(guān)。U2OS和U2OS/MTX300細(xì)胞均被幾種與骨肉瘤進(jìn)展密切相關(guān)的細(xì)胞因子治療，如TNFα、RANKL和M-CSF20-22。有趣的是，TNFα可以提高這些細(xì)胞中CBX4和Runx2的蛋白水平（圖4j）。TNFα增加Runx2蛋白水平依賴于CBX4或GCN5，可能是由于這些細(xì)胞中T437處CBX4磷酸化減少所致（圖4k-m）?？傊?，這些結(jié)果確定CK1α在T437處磷酸化CBX4促進(jìn)轉(zhuǎn)換，并與骨肉瘤的進(jìn)展相關(guān)。

5）CK1α通過(guò)抑制CBX4而起作用，它們?cè)诮M織中呈負(fù)相關(guān)
    我們研究了CK1α對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響。如圖5a-f所示，在U2OS、U2OS/MTX300和HOS細(xì)胞中使用shRNAs敲除CK1α，CBX4和Runx2蛋白水平以及細(xì)胞遷移和侵襲均增加。相反，CK1α在這些細(xì)胞中穩(wěn)定的外源表達(dá)降低了CBX4和Runx2的蛋白水平，以及細(xì)胞的遷移和侵襲（圖5g-l）。更重要的是，過(guò)表達(dá)CBX4廢除了由CK1α過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和入侵的抑制（圖5m）。這些結(jié)果表明，CK1α的過(guò)表達(dá)通過(guò)降低CBX4蛋白水平抑制了細(xì)胞的遷移和侵襲。

6）CK1α與CBX4在骨肉瘤組織中負(fù)相關(guān)
    我們?cè)u(píng)價(jià)了CK1α調(diào)節(jié)CBX4的臨床意義。結(jié)果表明，55個(gè)組織中有29個(gè)有高水平的CBX4，而55個(gè)組織中有19個(gè)有高水平的CK1α，這兩種蛋白的水平在這個(gè)隊(duì)列中呈負(fù)相關(guān)（圖6a，b）。高水平CK1α和CBX4分別與骨肉瘤患者較好和較差的總體生存率相關(guān)（圖6c，d）。此外，在24例診斷為轉(zhuǎn)移的患者中，高水平的CK1α（而不是CBX4）與更好的總體生存率相關(guān)（圖6e），盡管低水平的CBX4患者顯示出比高水平的CBX4患者有更好的生存曲線的趨勢(shì)，可能是由于小樣本量轉(zhuǎn)移（圖6f）。提示CK1α是預(yù)測(cè)骨肉瘤轉(zhuǎn)移患者臨床預(yù)后的重要指標(biāo)。

7）pyrvinium通過(guò)CK1α激活抑制CBX4抑制骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移
    恩波吡維銨（PP）是FDA批準(zhǔn)的一種選擇性激活CK1α亞型的藥物，在不同的癌癥模型中具有抗腫瘤作用。因此，我們很想確定PP是否對(duì)骨肉瘤轉(zhuǎn)移有影響。PP抑制U2OS/MTX300細(xì)胞內(nèi)CBX4的內(nèi)源性蛋白水平，但不抑制β-連環(huán)蛋白（圖7a）。同時(shí)，細(xì)胞遷移和侵襲受到損害，而PP處理的細(xì)胞內(nèi)源性CBX4 在T437位點(diǎn)的磷酸化水平增加（圖7b，c）。一致地，細(xì)胞內(nèi)的PP處理也增加了CBX4與CHIP的相互作用（圖7d）。
    最后，利用U2OS/MTX300-luci細(xì)胞，探討PP對(duì)骨肉瘤原位轉(zhuǎn)移模型的影響。如圖7e-j所示，shRNA對(duì)內(nèi)源性CBX4的敲除減少了細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，而野生型CBX4及其突變株K178/280A或T437A的重新導(dǎo)入完全挽救了這些細(xì)胞。此外，與K178/280A和T437A突變體相比，PP處理對(duì)野生型CBX4蛋白水平有更顯著的抑制作用。一致地，在穩(wěn)定表達(dá)shRNA和WT-CBX4的U2OS/MTX300細(xì)胞中，PP處理會(huì)損害細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，但不損害其K178/280A或T437A突變體（圖7h-j）。這些結(jié)果表明，PP通過(guò)誘導(dǎo)CBX4蛋白的降解而降低了骨肉瘤的轉(zhuǎn)移，提示PP在骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者的臨床試驗(yàn)中有一定的應(yīng)用價(jià)值。

結(jié)論：
    CBX4的過(guò)表達(dá)向Runx2啟動(dòng)子募集GCN5，轉(zhuǎn)錄上調(diào)Runx2，促進(jìn)骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移。CK1α在T437處磷酸化CBX4有利于其泛素化和CHIP降解，而PP作為CK1α的選擇性激活劑可能有利于高表達(dá)CBX4的骨肉瘤患者。