m6A閱讀器YTHDF1促進卵巢癌的進展

        m6A是哺乳動物mRNA中最豐富的RNA修飾，越來越多的證據(jù)表明m6A在人類腫瘤發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。然而，m6A的閱讀器YTHDF1，是否針對一個參與蛋白質(zhì)翻譯的基因，從而影響癌細胞的整體蛋白質(zhì)生產(chǎn)，目前還沒有很多的研究。因此小編為大家詳細介紹發(fā)表于“Nucleic Acids Research”雜志的文章“The m6A reader YTHDF1 promotes ovarian cancer progression via augmenting EIF3C translation”。在這里，通過對卵巢癌的多組分分析，我們確定了一種新的機制。YTHDF1通過與m6A修飾的EIF3C mRNA結(jié)合以m6A依賴的方式增強EIF3C的翻譯，同時促進整體翻譯輸出，從而促進卵巢癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

結(jié)果：
1.YTHDF1在卵巢癌中高表達
        為了研究m6A相關(guān)基因在卵巢癌發(fā)展中的作用，我們首先利用cBioPortal TCGA數(shù)據(jù)集分析這些基因的遺傳改變和表達水平。其中YTHDF1基因最常被擴增，其表達顯著升高，并且YTHDF1的拷貝數(shù)狀態(tài)與其在所有三個隊列中的mRNA表達呈正相關(guān)（圖1A-C）。與正常卵巢上皮細胞相比，YTHDF1在卵巢癌中表達上調(diào)（圖1D和E）。此外，我們進行了Kaplan-Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)高表達YTHDF1的卵巢癌患者總體生存率和無病生存率較差（圖1F）。為了更準確地檢測YTHDF1在卵巢癌中的表達，我們進行了組織芯片分析。結(jié)果顯示，YTHDF1蛋白在卵巢癌樣本中的表達高度增強（圖1G和H）。同時，這些結(jié)果提示m6A讀卡器YTHDF1在卵巢癌中高表達，并與卵巢癌患者的不良預后相關(guān)。

2.YTHDF1調(diào)節(jié)卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲
        為了探討YTHDF1在卵巢癌中的作用，我們試圖對缺失YTHDF1的卵巢癌細胞的表型改變進行研究。shY1-1和shY1-2在A2780和SKOV3卵巢癌細胞中有效地擊倒了YTHDF1（圖2A）。通過CCK8檢測，YTHDF1基因敲除顯著損害A2780和SKOV3細胞的生長（圖2B）。此外，EdU染色顯示YTHDF1沉默后卵巢癌細胞的增殖顯著降低（圖2C和D）。菌落形成分析顯示，YTHDF1基因敲除后克隆形成能力受到抑制（圖2E）。此外，細胞遷移和侵襲分析顯示，YTHDF1缺陷損害了A2780和SKOV3細胞的遷移和侵襲能力（圖2F和G）。提示YTHDF1在卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲中起重要作用。

3.YTHDF1缺乏抑制卵巢癌細胞在體內(nèi)的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移
        為了評價YTHDF1在卵巢癌體內(nèi)的致癌作用，我們采用皮下腫瘤模型和腹膜轉(zhuǎn)移異種移植模型。首先，在裸鼠皮下分別注射YTHDF1缺陷的A2780卵巢癌細胞和對照細胞。研究表明，來自YTHDF1缺陷組的腫瘤明顯小于來自對照組的腫瘤（圖3A）。同時，與對照組相比，YTHDF1基因敲除小鼠的平均腫瘤體積和犧牲時的體重顯著降低（圖3B和C）。我們還評估了這些實體瘤的細胞增殖和凋亡指數(shù)。與對照細胞相比，YTHDF1沉默的腫瘤顯示出Ki-67信號降低，但caspase-3活性增加（圖3D-F）。注射YTHDF1沉默的細胞實質(zhì)上消除了細胞在腹腔內(nèi)形成二次腫瘤的能力（圖3G）?？傊@些結(jié)果顯示了YTHDF1通過調(diào)節(jié)細胞增殖和轉(zhuǎn)移在卵巢癌中的致癌作用。

4.卵巢癌YTHDF1靶點的鑒定
        為了探討YTHDF1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，我們對YTHDF1基因敲除后的A2780細胞進行了RNA序列分析。YTHDF1缺失導致1715個基因發(fā)生改變，包括633個上調(diào)基因和1082個下調(diào)基因（圖4A）。MAPK信號途徑、腫瘤抑制和細胞遷移調(diào)控多種富集途徑和基因集富集分析（GSEA）揭示了YTHDF1基因的改變與蛋白質(zhì)磷酸化、凋亡信號途徑、MAPK途徑、ERK級聯(lián)和細胞活化等信號轉(zhuǎn)導有關(guān)（圖4B-F），支持YTHDF1在卵巢癌發(fā)生中的調(diào)節(jié)作用。
        YTHDF1起著m6A閱讀器的作用，通過結(jié)合和影響m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本發(fā)揮作用。我們分析確定了m6A共有基序（GGAC），表明m6A修飾的mRNA成功富集（圖4G）。這些m6A修飾主要位于蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本中，并在終止密碼子附近富集（圖4H 和4 I）。RIP-seq揭示了1698個潛在的YTHDF1候選靶點，其中93%是mRNA，這些基因在不同的途徑中富集（圖4J）。有趣的是，來自RNA-seq、m6A-seq和RIP-seq的基因重疊顯示，693個由YTHDF1結(jié)合的基因被m6A標記，其中647個（93.4%）基因在YTHDF1敲除后沒有改變（圖4K）。這些結(jié)果表明，YTHDF1并不影響其靶點的RNA豐度。此外，功能注釋顯示，這647個基因參與了包括翻譯、mRNA剪接和RNA內(nèi)穩(wěn)態(tài)在內(nèi)的多個RNA代謝過程（圖4L）。

5.EIF3C是YTHDF1的m6A修改靶點
        為了全面探討YTHDF1與其靶向轉(zhuǎn)錄本之間的直接相互作用，我們進行了eCLIP-seq，鑒定了2343個靶向轉(zhuǎn)錄物，這些轉(zhuǎn)錄物大部分是mRNAs（圖5A）。從eCLIP seq中還鑒定出m6A一致基序GGAC和YTHDF1結(jié)合偏好（圖5B和5C）。值得注意的是，175個基因被確認為YTHDF1的直接靶點（圖5D）。Circos圖顯示來自RIP-seq或eCLIP-seq的YTHDF1靶向基因被m6A修飾，但是它們的轉(zhuǎn)錄在YTHDF1基因敲除后沒有改變（圖5E），這表明YTHDF1可能調(diào)節(jié)卵巢癌細胞的翻譯而不是RNA豐度。
        接下來，我們分析了175個YTHDF1結(jié)合的mRNA中m6A峰和eCLIP峰的分布，其中一些與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄本中的大多數(shù)YTHDF1結(jié)合位點，包括EIF3C，與m6A 位點吻合良好（圖5F-J）。GO分析顯示，YTHDF1結(jié)合轉(zhuǎn)錄本與翻譯調(diào)控關(guān)系最為密切（圖4L）。CLIP qPCR顯示，YTHDF1最顯著地富集了EIF3C mRNA（圖5K）。這些數(shù)據(jù)表明EIF3C是卵巢癌細胞YTHDF1的直接靶點。

6.YTHDF1調(diào)節(jié)卵巢癌細胞EIF3C表達及整體翻譯輸出
        為了證實YTHDF1調(diào)節(jié)卵巢癌細胞中EIF3C的表達，我們首先檢測了EIF3C在YTHDF1缺失時的轉(zhuǎn)錄和翻譯。正如預期的那樣，YTHDF1沉默降低了A2780和SKOV3卵巢癌細胞中EIF3C的蛋白質(zhì)豐度，而不影響其RNA水平（圖6A和B）。然后我們通過基因特異性的m6A分析來評估EIF3C mRNA的m6A修飾狀態(tài)，觀察到EIF3C mRNA顯著富集（圖6C）。此外，RIP-qPCR證實了A2780和SKOV3卵巢癌細胞中YTHDF1和EIF3C mRNA之間的相互作用（圖6D）。
        隨著m6A修飾了EIF3C mRNA，我們接下來探究調(diào)節(jié)EIF3C表達的YTHDF1是否依賴于m6A。結(jié)果表明，卵巢癌細胞被YTHDF1寬型（YTHDF1 wt）或YTHDF1 mut結(jié)構(gòu)體轉(zhuǎn)染（圖6E）。隨后，用抗FLAG抗體和qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染YTHDF1 wt的細胞中，EIF3C mRNA被有效地免疫沉淀，但是YTHDF1突變體和EIF3C mRNA之間的相互作用顯著降低（圖6F）。Western blot分析顯示YTHDF1-wt能夠增強EIF3C-wt的表達，而YTHDF1-wt對EIF3C-mut的表達有輕微的影響（圖6G）。
        由于EIF3C是蛋白質(zhì)合成所必需的EIF3復合物的關(guān)鍵亞單位，我們接下來探討YTHDF1是否能影響卵巢癌細胞的整體翻譯輸出。結(jié)果表明，與對照細胞相比，在EIF3C基因敲除后，合成蛋白質(zhì)的HPG含量下降。類似地，與對照細胞相比，缺乏YTHDF1的細胞顯示出HPG信號下降（圖6H），表明YTHDF1可能影響整個蛋白質(zhì)合成。總之，這些數(shù)據(jù)表明，YTHDF1通過調(diào)節(jié)卵巢癌細胞中EIF3C蛋白的表達促進整體蛋白合成。

7.EIF3C在卵巢癌細胞中起致癌作用
        由于EIF3C在卵巢癌細胞中的作用尚不清楚，我們檢測了EIF3C的表達水平。與輸卵管相比，卵巢癌中EIF3C的蛋白表達顯著升高（圖7A和B）。為了進一步研究EIF3C在卵巢癌中的作用，我們分析了A2780和SKOV3細胞的細胞表型。兩種卵巢癌細胞系中的細胞生長和集落形成能力在EIF3C基因敲除后均明顯受到抑制（圖7C和D）。此外，EIF3C缺乏也減少了卵巢癌細胞的遷移和侵襲（圖7E和F）。這些結(jié)果表明EIF3C促進卵巢癌細胞的癌變。
        接下來，我們在YTHDF1缺陷的A2780和SKOV3細胞中過表達了EIF3C，并且在兩個細胞系中都恢復了EIF3C的表達（圖7G）。YTHDF1基因敲除損傷細胞生長和菌落形成，而EIF3C的過表達可以逆轉(zhuǎn)這種影響（圖7H）。在EIF3C過表達后，由YTHDF1缺失抑制的細胞遷移和侵襲被重新建立（圖7I和J）。這些結(jié)果提示EIF3C是YTHDF1促進卵巢癌進展的關(guān)鍵下游靶點。另外，YTHDF1的蛋白質(zhì)豐度與EIF3C的表達呈正相關(guān)（圖7K）?？傊?，增加YTHDF1的表達通過調(diào)節(jié)EIF3C的翻譯增強了整體蛋白的合成，并促進了卵巢癌細胞的腫瘤發(fā)生（圖7L）。

結(jié)論：
        我們的研究發(fā)現(xiàn)，EIF3C是卵巢癌細胞中YTHDF1的直接靶點。YTHDF1以m6A依賴的方式控制EIF3C的翻譯，并作為致癌調(diào)節(jié)因子影響整個蛋白質(zhì)翻譯。因此，靶向YTHDF1可能是卵巢癌治療的一個有前途的候選方案。