新突破！miR-126-5p對caspase-3的非典型抑制可通過動脈粥樣硬化自噬對內(nèi)皮細胞起到保護作用

    近日，一項刊登在國際雜志Science Translational Medicine(IF=16.304)上的文章 “The role of ferroptosis in ionizing radiation-induced cell death and tumor suppression”，來自德國慕尼黑大學(xué)等機構(gòu)的科學(xué)家們通過研究描述了一種miRNA分子異常不同的作用方式；研究人員表示，通過簡單地與miR-126-5p相互作用就能促進其轉(zhuǎn)移到細胞核中，并能抑制酶類caspase-3的活性，caspase-3主要會通過程序性細胞死亡的方式來殺滅細胞，以這種方式，miR-126-5p分子就能保護血管完整并減少動脈粥樣硬化的病變的程度。

    除了通過引導(dǎo)argonaute (AGO)蛋白靶向RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)中的RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達外，尚不清楚microRNAs (miRNAs)是否也可以通過其他機制調(diào)節(jié)細胞功能。miRNA發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄后活性，miRNA需要多種成分，如高分子量RISCs中含有適配器6A (TNRC6A)的三核苷酸重復(fù)，以便miRNA與目標mRNA的3' 端UTR'區(qū)域以及介導(dǎo)翻譯抑制或RNA衰減的酶相互作用。miRNAs可保留在與AGO2結(jié)合的低分子量復(fù)合物(LMW)中，不結(jié)合mRNA或參與靶mRNA抑制。盡管被看作是一個miRNA庫, 這些復(fù)合物是否能使宿主miRNAs蛋白相互作用，而且這些蛋白不參與典型的RISC功能。這些miRNAs是否能對蛋白質(zhì)活性發(fā)揮直接的翻譯后作用，以及這與它們在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運有何關(guān)系。
    LMW復(fù)合物的組裝是由哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)復(fù)合物I控制的，并且主要受mTOR抑制. mTOR的抑制是自噬最強大的觸發(fā)因素之一，自噬是真核細胞用來適應(yīng)應(yīng)激、維持營養(yǎng)穩(wěn)態(tài)的分解過程, 用于介導(dǎo)質(zhì)量控制和受損細胞器和蛋白質(zhì)聚合體的溶酶體降解。在內(nèi)皮細胞(ECs)中，自噬通量通過mTOR途徑被高剪切應(yīng)力(HSS)觸發(fā)，并在動脈粥樣硬化的易感區(qū)域受損，但在這一背景下，層切應(yīng)力和自噬調(diào)節(jié)miRNA命運和功能的機制尚不清楚.
    Krüppel-like家族的轉(zhuǎn)錄因子(KLFs)是自噬的重要調(diào)控因子，是控制成熟miRNA表達的miRNA加工機制的變阻器。KLF2在動脈內(nèi)皮細胞中協(xié)調(diào)大部分剪切應(yīng)力誘發(fā)的轉(zhuǎn)錄程序，并且是斑馬魚血流量依賴性miR-126表達所必需的。在內(nèi)皮高表達的mirna中，miR-126雙鏈有助于血管生成和血管完整性，具有特異功能和穩(wěn)態(tài)穩(wěn)定。miR-126-5促血管生成和抗炎信號傳導(dǎo)，miR-126-5p維持EC增殖儲備，調(diào)節(jié)不同的靶點和通路。根據(jù)功能差異，只有miR-126-5p在動脈內(nèi)皮細胞層流中上調(diào)，以限制HSS區(qū)域的動脈粥樣硬化(16)。盡管這兩條鏈是由一個共同的前體由核糖核酸內(nèi)切酶Dicer處理的，但它們的動脈數(shù)量不受EC特異性Dicer缺失的影響。因此，miR-126鏈的差異調(diào)控并不依賴于轉(zhuǎn)錄或處理，這使得諸如剪應(yīng)力引起的自噬等潛在機制有待闡明。在本研究中，我們試圖詳細說明EC自噬在HSS上的strand特異性調(diào)控和miR-126在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運中的作用，并明確鑒定了RNA結(jié)合蛋白Mex3a在miR-126-5p核富集中的作用。
    研究者Donato Santovito說道，較高的剪應(yīng)力往往會在內(nèi)皮細胞觸發(fā)一個多步驟過程，從而導(dǎo)致miR-126-5p和RNA結(jié)合蛋白之間形成分子復(fù)合體，隨后這種復(fù)合體就會被運輸?shù)郊毎酥?。一旦進入細胞核，miR-126-5p就會被復(fù)合體釋放并與caspase-3酶結(jié)合從而抑制其活性，caspase-3自身是程序性細胞死亡的一個重要介導(dǎo)子，如今研究者知道多種因素能夠增加機體患動脈粥樣硬化的風(fēng)險，并促進內(nèi)皮細胞發(fā)生細胞凋亡；比如血流紊亂、高水平膽固醇和高水平葡萄糖，因此，通過抑制caspase-3酶，細胞核的miR-126-5p就能保護內(nèi)皮細胞免受誘導(dǎo)性的細胞死亡，此外，這樣還能減少高剪應(yīng)力部位內(nèi)皮細胞對損傷的敏感性，這的確是一種保護機體抵御動脈粥樣硬化的機制，因此，通過維持內(nèi)皮細胞表面的完整性，miRNA就對整個機體血管系統(tǒng)做出了重要貢獻。最后，研究者Weber表示，miR-126-5p迄今為止未知的功能代表了一種生物學(xué)調(diào)節(jié)原理，其能補充此前未被研究人員很好描述的機制，后期研究人員希望能夠通過與其他研究人員同理合作來調(diào)查是否其它miRNAs分子也能以類似的方式來發(fā)揮作用，此外，進一步闡明這種信號通路作用的機制或為后期科學(xué)家們開發(fā)治療心血管疾病的新型療法提供新的思路。

Figure1：klf2誘導(dǎo)的自噬引起miR-126鏈的差異調(diào)控和miR-126-5p核定位

(A)pre - miR-126、miR-126- 3p和miR-126-5p在KLF2過表達HUVECs (n = 5 ~ 7)和(B) cdh5crecreklf2fl /fl (klf2eci - ko)和對照組(野生型(WT))主動脈內(nèi)膜中的表達(n = 4 ~ 5)。
(C) Western blot分析KLF2過表達后的自噬標記，(D)密度測定LC3-II/LC3-I比值和p62表達(歸一化為-actin) (n = 4)。
(E)雷帕霉素和巴菲霉素處理的HUVECs中miR-126-3p和miR-126-5p的含量(n = 6)。
(F)有無雷帕霉素處理的HUVECs中miR-126-3p和miR-126-5p模擬物的代表性免疫熒光(綠色)。標尺，5米。
(G)定量每個細胞的細胞質(zhì)模擬病灶(n = 4 ~ 5)和(H)模擬和Hoechst核染料的皮爾遜s共定位系數(shù)(n = 39 ~ 69個細胞)。
(I) 雷帕霉素處理后內(nèi)源性miR-126鏈在HUVECs中的核漿分布(n = 4)。
(J) 在接受雷帕霉素和沉默的自我吞噬病原蛋白質(zhì)(ATG5或ATG7)或cotreated importin抑制劑伊維菌素(n = 3 - 6) HUVECs中，細胞核(Nuc)和細胞質(zhì)(Cyto)中miR-126-5p的含量 (K) 在自噬速率限制蛋白(ATG5或ATG7)沉默或輸入素抑制劑伊維菌素(n = 3 ~ 6)和(K)共處理的HUVECs中細胞核(Nuc)和細胞質(zhì)(Cyto)中miR-126-5p的含量。

Fig. 2: miR-126-5p的優(yōu)先核轉(zhuǎn)移與其種子序列無關(guān)

(A) qPCR檢測經(jīng)或不經(jīng)雷帕霉素處理的HUVECs中miR-21、let-7a、miR-17和miR-126的細胞核和細胞質(zhì)數(shù)量(n = 3至4)。
(B) HUVECs中轉(zhuǎn)染miR-126-5p序列和突變體(Mut1到Mut3)。
(C)共聚焦顯微鏡顯示miR-126-5p (Nat-5p)和突變體(Mut1到Mut3，紅色)在4,6 -二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色核(灰色)中定位。
(D)定量三維反褶積和渲染后評估的突變體所占的平均核體積(n = 4至6)。

Fig. 3: 核miR-126-5p與RNA結(jié)合蛋白Mex3a和AGO2相互作用

(A)免疫熒光法檢測拉帕霉素處理的HUVECs和對照組的AGO2和LC3，并定量AGO2陽性細胞核細胞。Insets顯示同步信號(白色箭頭)(n = 5)。標尺，20米。
(B) rapamycin處理的HUVECs中細胞核和細胞質(zhì)AGO2的RNA-IP顯示miR-126鏈負載。
(C) STED nanoscope在lc3界限的囊泡外表面顯示AGO2信號(白色箭頭)。標尺，200nm。
(D) AGO2和Mex3a在雷帕霉素治療的HUVECs中的Co-IP。
(E) 3D共聚焦顯微鏡觀察rapamycin處理的HUVECs和對照組細胞核中的AGO2和Mex3a。標尺，5米。
(F)修飾的納米鏡詳細描述了rapamycin治療的HUVECs中AGO2:Mex3a:LC3細胞質(zhì)復(fù)合物。標尺，1米(頂部)。兩個熒光通道(AGO2與LC3和Mex3a與LC3)在底部面板顯示復(fù)合物的放大。

Fig. 4: Mex3a優(yōu)先結(jié)合miR-126-5p來驅(qū)動核富集

(A)在沒有miR-126-5p(摩爾比，1:2)或存在miR-126-5p(紅色)情況下，Mex3a(KH1KH2) 1H-15N HSQC光譜的覆蓋。
(B)固定miR-126-5p與全長Mex3a相互作用的SPR傳感器圖。KD = 3.6 2.9 nM。
(C)無miR-126-5p(藍色)或有miR-126-5p(紅色)時，來自Mex3a(KH1KH2)的SAXS的成對距離分布。
(D) Mex3a與miR-126-5p和miR-126-3p相互作用的估計結(jié)合親和參數(shù)表。
(E)未使用(Ctrl)和使用雷帕霉素(Rapa)處理的HUVECs核裂解液中Mex3a的RNA-IP顯示miR-126鏈負載(n = 3)。
(F) SPR傳感器圖顯示序列加載的全長重組蛋白Mex3a和AGO2 (Exp1)在固定化miR-126-5p上相互作用，反之亦然(Exp2)。
(G)全長Mex3a、miR-126-5p或其組合灌注在AGO2上的SPR檢測圖顯示，在與miR-126-5p的復(fù)合物中，Mex3a和AGO2有明顯的相互作用。
(H)有或沒有Mex3a KD的rapamycin治療的HUVECs中，miR-126-5p(灰色)的熒光原位雜交(FISH)和AGO2(綠色)和Mex3a(紅色)的典型反壓縮圖像。
(I)雷帕霉素和Mex3a沉默后HUVECs中核miR-126-5p的數(shù)量(n = 5)。

Fig. 5: 核miR-126-5p抑制細胞凋亡

(A)雷帕霉素和miR-126-5p誘導(dǎo)ec相關(guān)基因變化的Circos圖。熱圖顯示了與對照組(內(nèi))和與雷帕霉素和miR-126-5p模擬物或抑制劑(外)處理的細胞相比，雷帕霉素處理的HUVECs的相對表達。KEGG功能類別以條帶表示，(B)按褶皺富集程度排序。HIF-1，缺氧誘導(dǎo)因子1;ECM,細胞外基質(zhì);TNF，腫瘤壞死因子。
(C)對對照組和雷帕霉素處理的具有miR-126-5p的凋亡介質(zhì)進行Western blot分析，或(D)在Mex3a KD與對照組siRNA (nc)對比后進行細胞凋亡介質(zhì)的Western blot分析，包括標準化密度分析。PARP,保利(ADP-ribose)聚合酶。
(E)代表流式細胞儀分析和量化(F)的細胞凋亡率(膜聯(lián)蛋白V +細胞百分比)雷帕霉素治療后3小時(n = 10)和mir - 126 - 5 - p抑制(5 p異煙肼)(n = 10)或Mex3a KD (n = 10) (G)在Mex3a超表達有或沒有mir - 126 - 5 - p抑制劑(n = 7), 7-AAD 7-aminoactinomycin D;FITC,異硫氰酸熒光素。

Fig. 6: miR-126-5p與caspase-3相互作用抑制其活性

(A) miR-126-5p魚的典型反卷積圖像(紅色)和caspase-3的共免疫染色(綠色)顯示細胞核和核周圍區(qū)域的共定位信號(白色箭頭)。圖中顯示了在橙色箭頭標記的位置上綠色和紅色通道的歸一化熒光強度曲線。標尺，5米。
(B)代表deconvoluted圖像為魚mir - 126 - 5 - p和coimmunostaining caspase-3 rapamycin-treated HUVECs轉(zhuǎn)染與小干擾rna(數(shù)控siRNA)或非特異性核對抗Mex3a (Mex3a KD)和(C)皮爾森系數(shù)caspase-3和mir - 126 - 5 - p colocalization,紅線表示中位數(shù)(n = 100 - 110)。
(D) RNA-IP核和細胞質(zhì)caspase-3 mir - 126鏈加載HUVECs對待雷帕霉素(n = 6)或暴露于層流剪切應(yīng)力(高速鋼、12達因/ cm2) (n = 3)和控制(n = 9)。(E) Biotin-RNA下拉HUVECs mir - 126股轉(zhuǎn)染的顯示與Mex3a互動和caspase-3雷帕霉素治療后。
(F)在雷帕霉素處理的HUVECs中miR-126-5p突變體和caspase-3共定位的Pearson s系數(shù)(n = 4)。紅色代表變異的核苷酸。
(G) 1H13C甲基ILVM、2h標記的caspase-3(藍色)與miR-126-5p復(fù)合物(紅色)的二維核磁共振譜疊加，摩爾比為1:3。
(H)利用AGO2和caspase-3對固定化miR-126-5p競爭性結(jié)合實驗(n = 3)， IC50 = 126.9 nM。(我)Competition-binding試驗使用caspase-3單體和mir - 126 - 5 - p (n = 3)。IC50 = 6.0 M (J)分析游離caspase-3活動存在mir - 126 - 5 - p (Nat-5p), mir - 126 - 5 - p突變(Mut3), mir - 126 - 3 - p (Nat-3p)(4、8、16米),核糖核酸酶,caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK (DEVD),或Z-VAD-FMK(10米)(n = 3)。

Fig. 7: 刪除Atg5或Mex3a可減弱細胞核miR-126-5p-AGO2的穿梭，從而在體內(nèi)驅(qū)動內(nèi)皮細胞凋亡和動脈粥樣硬化

(A) 3 d反褶積顯微鏡(B)量化LC3 +區(qū)域和(C) ECs的百分比顯示核LC3在面對主動脈弓(低剪切應(yīng)力(LSS)]與胸主動脈(高剪切應(yīng)力(HSS)]的載脂蛋白e /老鼠(n = 3 - 6) fed chow (CD)或高脂肪飲食(HFD) 4到12周。
(G) (D)免疫熒光和ECs的百分比顯示核AGO2 (D和E)主動脈弓(LSS)和胸主動脈(HSS)的載脂蛋白E /老鼠(n = 3)在HFD 12周或(F和G)人類頸動脈標本收集上游(HSS)和下游(LSS)的分岔(n = 7)。地區(qū)I和II (D和F)的放大了ECs的insets顯示單通道的細節(jié),沒有(我或空箭頭)和核AGO2 (II或填充箭頭)。標尺，20米。
(H)在人類頸動脈標本的分叉上游(HSS)或下游(LSS，覆蓋動脈粥樣硬化)中，共聚焦去折疊顯微鏡檢查Mex3a免疫染色，并FISH檢查經(jīng)vWF染色的ECs核中的miR-126-5p (n = 3)。標尺，20米。
(I)定量EC核內(nèi)Mex3a與miR-126-5p的最近距離，每個區(qū)域12個視野。分布顯示了總距離和(J)相互作用代理定義的距離低于分辨率限制240納米。(K to P)對Apoe / Cdh5Cre+Atg5fl/fl (ATG5EC-KO)和Apoe / cdh5c -Atg5fl/fl WT小鼠進行為期12周的實驗研究。
(K)胸主動脈顯示細胞核AGO2(免疫熒光)和(L) miR-126-5p(原位PCR)的ECs百分比(n = 3)。
(M) miR-126-5p在主動脈弓(LSS)和胸主動脈(HSS)中的核表達(n = 4 ~ 5)。
(N)血漿中的循環(huán)內(nèi)皮抗體(N = 8 ~ 10)。
(O)油紅色主動脈的動脈粥樣硬化病變區(qū)域，(P)主動脈弓(LSS)和胸腹主動脈(HSS)的部分貢獻(n = 6 ~ 9)。
(Q) C57Bl6/NCrl (WT)和Mex3a /小鼠胸主動脈ECs顯示細胞核AGO2的百分比(n = 4)。
(R) FISH檢測WT和Mex3a /小鼠en face胸主動脈中miR-126-5p，共免疫染色檢測caspase-3和CD31。標尺，20米。
(S)顯示核miR-126-5p和(T) caspase-3的ECs百分比(n = 3至4)。
(U)分叉下游(LSS)或上游(HSS)人類頸動脈標本中顯示核miR-126-5p和caspase-3的ECs百分比(n = 3)。